单基因+肿瘤耐药性分析+实验验证，轻松拿下5+！- 大数跨境

中科生信

2023-11-02

导读：今天小编和大家分析一篇2023年10月发表在《Cancer Cell International》

今天小编和大家分析一篇2023年10月发表在《Cancer Cell International》（IF:5.8）期刊上的文章《GAD1 contributes to the progression and drug resistance in castration resistant prostate cance》。

背景：

根据2020年全球癌症统计数据，前列腺癌已成为第三大最常见癌症，占新发癌症的7.3%，仅次于乳腺癌和肺癌，其死亡率约占全球男性癌症相关死亡的7%。前列腺癌的标准治疗方法是雄激素剥夺疗法，但在治疗18-24个月后会发展为去势抵抗性前列腺癌（Castration-resistant prostate cancer，CRPC）。目前相关指南推荐的治疗CRPC的两种主要治疗方案是化疗（多西他赛等）以及新型内分泌疗法（苯扎鲁胺等）。

自2004年以来，多西他赛联合泼尼松一直是CRPC的标准疗法，可提高总生存期（OS）。遗憾的是，40%-50% 的CRPC对多西他赛有反应，但PSA并未出现显著、持续的下降，且中位反应持续时间仅限于6-9个月。此外，许多研究还发现，CRPC患者在使用多西他赛后会出现致命的耐药性，其原因包括微管蛋白-β3 的异常表达、p-糖蛋白的过度表达、刺猬信号通路的异常激活以及 AR 的异常转录等。现有证据表明，临床上大多数CRPC的发生与AR信号通路的再激活直接相关，因此恩杂鲁胺等新型AR靶向药物已被证实能有效延长CRPC患者的OS。遗憾的是，与多西他赛相似，恩杂鲁胺治疗后CRPC患者的OS仅能改善4-6个月。这可能是由于AR剪接变体的出现、糖皮质激素受体的表达、ARF876L结构域突变和神经内分泌分化等多种因素导致前列腺癌患者对恩杂鲁胺产生耐药性。面对多重因素导致耐药的现状，药物的有限疗效和耐药致死率正成为临床亟待解决的难题。然而，前列腺癌的耐药机制尚未完全明了，仍缺乏更精确有效的预后生物标志物和潜在的治疗靶点。本研究对前列腺癌多西他赛耐药基因组和恩扎鲁胺耐药基因组进行基因组生物信息学分析，以确定潜在的靶基因。该研究有望深入了解前列腺癌耐药的分子机制，并探索其预后生物标志物和潜在的耐药治疗靶点。

流程图如下：

方法：

PARVA、ATP2B4、SH3BGRL 和 GAD1 是导致前列腺癌耐药性的潜在基因
GAD1 是影响前列腺癌进展和耐药性的枢纽基因
GAD1 基因突变和甲基化与前列腺癌的临床病理特征和免疫微环境有关
GAD1 与前列腺癌药物代谢和免疫治疗途径的关系
体外实验中 GAD1 对前列腺癌进展和药物敏感性的影响

研究结果：

PARVA、ATP2B4、SH3BGRL 和 GAD1 是导致前列腺癌耐药性的潜在基因

从基因表达总库（GEO）数据库中筛选出283个前列腺癌多西他赛耐药基因和1158个前列腺癌恩杂鲁胺耐药基因（至少在三个细胞系亚群中共同表达）（图2A、B），得到72个共同表达的耐药基因（图2C）。通过单变量 Cox 回归分析，初步发现其中 15 个基因与无进展间期（progress free interval，PFI）显著相关（图 2D）。

随后，经过 TCGA-PRAD 队列的验证，发现 parvin alpha (PARVA)、ATPase plasma membrane Ca2 + transporting 4 (ATP2B4) 和 SH3 Domain Binding Glutamate Rich Protein Like (SH3BGRL) 在前列腺癌中低表达，而这些基因相应低表达的患者 PFI 明显较低（图 2E-J）。与此相反，GAD1 被证明是一种促癌基因（图 2E）。其余 11 个基因因在前列腺癌和癌旁组织中无差异表达或表达与预后不一致而未被考虑，包括 NFIB、RHOBTB3、SEMA3C、AKRIC3、NRP1、ALDH1A3、CTSC、IGFBP3、GLS、ARG2、COL5A1（图 2E、I）。有价值的预后耐药基因数据与来自 GEO 的 logFC 数据相结合，进行基因本体论和京都基因与基因组百科全书（GO-KEGG）分析，结果显示这些基因在 GO:0003148（流出道隔膜形态发生）、GO:0009065（谷氨酰胺族氨基酸代谢过程）和 GO:0048786（突触前活性区）生物过程中具有功能富集（图 2K）。

GAD1 是影响前列腺癌进展和耐药性的枢纽基因

为了进一步确定最关键的耐药基因，上述四个基因（PARVA、ATP2B4、SH3BGRL 和 GAD1）被加入到 TCGA-PRAD 的 OS 分析中。基于 PFI，使用 Lasso Cox 回归构建了相关的风险预后模型，根据中位风险评分将患者分为高风险组和低风险组。使用 t 分布随机邻域嵌入和主成分分析显示了不同组的生存状态和枢纽基因热图；结果显示，GAD1 在高危组中表达量较高，而 PARVA、ATP2B4 和 SH3BGRL 在高危组中表达量较低。由于 HR = 2.216，预后模型为风险因素模型，且高危组的中位生存时间明显短于低危组。最后，通过接收者操作特征曲线（ROC）评估了模型的预后预测效率，发现曲线下面积（AUC）分别为 0.611（1年OS）、0.660（3年OS）和 0.581（5年OS）。有趣的是，只有 GAD1 被证实是影响前列腺癌 OS 的中枢耐药基因（图 3A）。

进一步研究了 GAD1 表达与前列腺癌临床病理特征之间的关系，发现GAD1 在 T3 期和 N1 期的表达分别高于 T2 期和 N0 期（图 3B、C）。随后，探讨了GAD1表达与初治结果和前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）的相关性，发现GAD1在PSA≥4 ng/mL和部分应答中的表达分别高于PSA<4 ng/mL和完全应答中的表达（图3D、E）。GAD1 的表达与 Gleason 评分之间存在很强的相关性：Gleason 评分高的患者的 GAD1 表达水平明显高于评分低的患者（图 3F）。最终，GAD1随时间变化的ROC曲线显示，AUC1-year-os = 0.587，AUC3-year-os = 0.637，AUC5-year-os = 0.610（图 3G）。此外，将前列腺癌中与 GAD1 表达相关的临床病理因素结合起来创建预后列线图，结果表明结合指数能更好地评估患者的 PFI（C 指数 = 0.782，p = 1.94e-14）（图 3I）。此外，预测概率的校准曲线与列线图上的 1 年、3 年和 5 年 PFI 非常吻合，其中 3 年 PFI 的拟合效果最好（图 3H）。

GAD1 基因突变和甲基化与前列腺癌的临床病理特征和免疫微环境有关

上述分析初步确定 GAD1 是影响前列腺癌进展和耐药性的重要基因。来自 cBioPortal 的 TCGA-PRAD 队列显示，GAD1 在总体人群中的突变率为 3%，包括深度缺失和错义突变（图 4A）。进一步分析表明，GAD1突变主要集中在T2期（T2a和T2c）和前列腺中期（图4B、C），而且与癌症诊断晚期和较高的基因组改变率有关（图4D、E）。然而，突变增加的患者显示出 PFI 较差的趋势（p = 0.159）（图 4F）。此外，最常与 GAD1 突变相关的通路是磷酸酶和天丝蛋白同源物-磷脂肌醇3- 激酶通路（图 4H）。通过 UALCAN 对前列腺癌中 GAD1 启动子甲基化水平进行了研究，发现GAD1启动子甲基化水平在前列腺癌中明显高于正常组织，而且在老年患者中明显更高（图4H，I）。此外，GAD1 启动子甲基化在 N0 和 N1 期明显高于正常组织，但在统计学上无明显差异（图 4J）。GAD1突变的信号通路主要与肿瘤蛋白53（TP53）有关；在TP53突变的前列腺癌患者中，GAD1启动子的甲基化程度较高（图4K）。最后，对GAD1表达和甲基化相关基因的评估显示与甲基转移酶1 tRNA甲基鸟苷（METTL1）、推测RNA结合蛋白15-RNM结合蛋白（RBM15）、YTH域包含1（YTHDC1）、YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白3（YTHDF3）、胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白2（IGF2BP2）、IGF2BP3和RNA结合基序蛋白X-linked（RBMX）基因显著相关（图4L)。

接下来探究了GAD1 是否会通过影响肿瘤免疫微环境而加速前列腺癌的进展和耐药性，发现GAD1 的表达和甲基化大多与淋巴细胞、免疫抑制因子、免疫刺激因子、MHC 分子、趋化因子和趋化因子受体呈正相关（图 5A-F）。然而，GAD1拷贝数与上述免疫学评价指标大多不相关或仅有微弱的正相关或负相关（图5A-F）。在前列腺癌中，GAD1的表达与Tem CD8、Th1、CD56dim、MDSC和巨噬细胞呈显著正相关（图 5A）；GAD1 的甲基化与 Tem CD4、Th2、NK和iDC呈显著正相关（图 5B），与巨噬细胞无显著相关（图 5A）。GAD1的表达与免疫抑制剂呈正相关，如CTLA4、LAGLS9、TGFB1，其甲基化与CD274、KDR、PDCD1LG2呈正相关（图5B）。GAD1的表达与免疫刺激剂呈正相关，如TMEM173、TNFRSF18、TNFRSF25呈正相关，其甲基化与NT5E、TNFSF13B、TNFSF15呈正相关。此外，GAD1拷贝数与CD276、ICOSLG和ULBP1呈负相关（图5C）。GAD1 的表达与 MHC 分子，如 HLA-DMA、HLA-DOB、HLA-F呈正相关，GAD1 的甲基化与 HLA-DPA1、HLA-DRA 、HLA-E呈正相关（图 5D）。GAD1 的表达与 CCL2、CCL21、CXCL14等趋化因子呈正相关，GAD1 的甲基化与 CCL14、CXCL12呈正相关。此外，GAD1 的拷贝数与 CXCL11 呈弱负相关（图 5E）。GAD1的表达与趋化因子受体CCR10、CXCR4呈正相关，其甲基化与CCR2、CCR4、CXCR2呈正相关（图5F）。上述研究表明，与冷肿瘤特征不同，GAD1的表达和甲基化与前列腺癌中的巨噬细胞和淋巴细胞均有显著相关性。

随后，对前列腺癌和癌旁组织中 GAD1 与免疫检查点的关系的进一步研究显示，GAD1 与 CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、TIGIT 和 SIGLEC15 有明显的关联，这可能导致人们推测它们是 PRAD 治疗和诊断的敏感免疫检查点（图 5G）。然后，肿瘤免疫功能障碍和排除算法预测了低 GAD1 基因型的耐药前列腺癌对免疫检查点抑制剂的良好反应性（图 5H）。进一步通过 TMB和 MSI，发现 GAD1 与 PD1 抗体治疗反应结果相关（图 5I、J）。因此，这表明 GAD1 可能是免疫疗法的潜在靶点和预后生物标志物。

GAD1 与前列腺癌药物代谢和免疫治疗途径的关系

在TCGA-PRAD队列中，GAD1单基因差异分析结合GSEA富集分析发现，通路主要与多种免疫相关通路有关，如B细胞受体、核因子卡巴B（NFkB）激活、白细胞介素（IL）-4和IL-13、T细胞受体、整合素细胞表面相互作用等（图6A）。同时发现GAD1通路与KEGG_DRUG_METABOLISM_OTHER_ENZYMES之间存在显著相关性，这预示着GAD1可能会影响多西他赛或恩杂鲁胺的代谢，从而导致前列腺癌患者产生耐药性（图6B）。此外，在多个通路中，我们观察到GAD1与免疫疗法和免疫检查点通路有显著的关联，包括KEGG_PRIMARY_IMMUNODEFICIENCY、WP_INFLAMMATORY_RESPONSE PATHWAY、REACTOME_PD_1_SIGNALING和BIOCARTA_CTLA4_PATHWAY，NES均大于1.600，p.adj＜0.05，FDR＜0.05（图6C-F）。

最后，为了更全面、综合地阐明 GAD1 在前列腺癌中的功能，根据前任研究整合了相关通路的基因组，并依次计算了每个样本在每条通路上的富集分，从而得到样本与通路之间的联系。在前列腺癌中，GAD1 明显参与了以下相关基因通路组合：肿瘤炎症、EMT 标记、ECM 相关基因、血管生成、细胞凋亡、炎症反应、p53 通路、TGFβ、IL10 抗炎信号通路、活性氧化物上调基因、胶原形成和 ECM 降解。

体外实验中 GAD1 对前列腺癌进展和药物敏感性的影响

癌症细胞系百科全书（CCLE，https://portals.broadinstitute.org/ccle/about）数据库分析表明，GAD1在前列腺癌细胞系NCI-H660、DU145、PrEC LH和PC3中高表达（图7A）。选用现有的前列腺癌细胞系进行了 RT-PCR 验证，发现 LNCaP 和 PC3 中 GAD1 的表达高于 RWPE1 细胞，因此选择这些细胞系进行后续验证（图 7B）。通过 RT-PCR 验证了 GAD1 小干扰试剂在 LNCaP 和 PC3 中的敲除效率（图 7C，D）。随后，在 LNCaP（图 7G）和 PC3 细胞（图 7H）中，siGAD1 组在 24 和 48 h 的划痕愈合效率低于 ncGAD1 组。在克隆检测中，siGAD1 组 LNCaP 细胞（图 7E）和 PC3 细胞（图 7F）的细胞克隆数量明显低于 ncGAD1 组。

此外，通过细胞迁移和侵袭试验，siGAD1 组对 LNCaP（图 7I）和 PC3 细胞（图 7J）的细胞迁移和侵袭能力有明显的下调作用。由于 LNCaP 细胞是 AR 激素依赖性前列腺癌细胞，因此选择它们来验证药物敏感性。首先，研究发现 siGAD1 的生长曲线明显慢于 ncGAD1（图 7K）。药物敏感性测试结果显示：siGAD1 恩杂鲁胺半最大抑制浓度（IC50）= 262.1 μM，ncGAD1 恩杂鲁胺 IC50 = 335.5 μM（图 7L）。此外，siGAD1 多西他赛 IC50 = 10.79 μM，ncGAD1 恩杂鲁胺 IC50 = 20.41 μM（图 7M）。这些结果表明，GAD1基因敲除增加了前列腺癌细胞对恩杂鲁胺和多西他赛的敏感性。最后，在人类蛋白质图谱数据库（HPA）(https://www.proteinatlas.org)的帮助下，证实了GAD1在前列腺组织（图7N）、高级别前列腺癌（图7O）和低级别前列腺癌（图7P）中的表达呈上升趋势，这与GAD1在不同级别前列腺癌中的表达一致（图3F）。此外，对前列腺癌患者进行的免疫组化显示，前列腺癌组织中 GAD1 的表达明显高于癌旁组织（图 7Q）。

【声明】内容源于网络

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