2区7+！TCGA+scRNA-seq+机器学习，糖酵解相关分子在结直肠癌患者中的研究- 大数跨境

2区7+！TCGA+scRNA-seq+机器学习，糖酵解相关分子在结直肠癌患者中的研究

中科生信

2023-09-20

导读：大家晚上好！今天小编和大家分享一篇23年5月发表在(IF:7.300)杂志的文章《Machine learn

大家晚上好！今天小编和大家分享一篇23年5月发表在(IF:7.300)杂志的文章《Machine learning-based glycolysis-associated molecular classification reveals differences in prognosis, TME, and immunotherapy for colorectal cancer patients》。作者通过共识聚类以及机器学习等方法，系统性地分析了糖酵解相关分子在结直肠癌患者中的突变、生存以及肿瘤微环境之间的关联。对于糖酵解相关方向的分析思路有兴趣的老师可以与我们联系，方法适用于其他分子。

背景

糖酵解是能量转化的关键形式，将葡萄糖转化为丙酮酸，最终产生乳酸并为肿瘤细胞提供氧非依赖性能量。即使在有氧环境中，肿瘤细胞仍然可以限制糖酵解的能量代谢，通常称为需氧糖酵解。通过减少细胞抑制和凋亡，糖酵解为肿瘤细胞生长创造条件。越来越多的证据表明，糖酵解与结直肠癌的发展有关。许多糖酵解相关基因，包括乳酸、GLUT1、丙酮酸激酶M2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、烯醇化酶-1、乳酸脱氢酶5和己糖激酶2，目前被发现在结直肠癌中上调。同时也有证据表明，糖酵解对于控制肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）之间的相互作用至关重要。在这项研究中，作者使用无监督聚类方法使用糖酵解相关的基因对每个CRC患者进行分类。然后讨论了每个糖酵解相关簇（GAC）的临床、基因组学、TME和富集途径的特征。同时还将每种GAC类型映射到单细胞数据，分析了每个细胞中每种GAC样亚型的分布和功能。基于上述发现，作者整合了单细胞和普通RNA-seq的结果，以开发一个模型来预测每个CRC患者的GAC并对其进行验证，并探索了其在治疗中的作用。

方法

1，k-means方法和ConsensusClusterPlus包进行了共识聚类；

2，survival and survminer包进行Kaplan-Meier生存分析；

3，GSVA包探索每个GAC富集的途径；

4，CMScaller包确定CRC患者的CMS归类；

5，Seurat包对scRNA-seq数据进行处理；

6，metafor包中的rma功能确定重要的细胞亚型；

7，monocle3包进行拟时序分析；

8，glmnet，randomForest，Boruta，XGBoost，e1071和caret包筛选重要基因；

9，pROC和caret包计算ROC曲线下的AUC面积；

10，pRRophetic包计算药物的半抑制浓度（IC₅₀）值。

技术路线

研究结果

1.结直肠癌中糖酵解相关分子簇的分类

研究技术路线如图1。从MSigDB数据库（HALLMARK_GLCOLYSIS）收集198个糖酵解相关基因进行进一步研究。采用GO富集分析发现，这些基因主要富集到碳水化合物和衍生物（图2A)。PCA降维可视化了TCGA COAD/READ数据集中正常组织和肿瘤组织之间糖酵解相关基因的分布，结果表明糖酵解相关基因可有效将肿瘤与正常组织分离（图2B)。为了研究这些基因在肿瘤发生中发挥的潜在作用，我们使用共识聚类对TCGA和GEO数据集中CRC患者进行分类，并确定了三个糖酵解相关簇（GAC）如图2C。T-SNE分析显示每种GAC的分布呈现显著异质性（图2D)。

2.GAC之间的临床差异

在GAC聚类的基础上，我们讨论了每种GAC相应的临床特征。三种GAC的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）的生存曲线表明，GAC2的预后较差（TCGA-OS: p = 0.05; TCGA-DFS: p = 0.03; GEO-OS: p< 0.001; GEO-DFS: p = 0.011, log-rank test）（图2E–H)。临床分期与GAC的关系表明，GAC2的比例随分期的进展而增加，而GAC3的比例呈现相反趋势，这与GAC2的不良预后一致（图3C）。根据图3A，GAC1的Kras突变比例较大，而GAC3的Braf突变和MSI-H状态比例较高。此外，GAC2的年龄分布最年轻。因此以上结果表明GACs的临床特征具有异质性：1.GAC2预后较差，分期较晚，呈年轻化趋势；2.GAC3预后较好，分期较早，突变概率较高。3. GAC1在各种临床特征中处于中间位置。

3.每个GAC分类的生物学差异和特征

利用“GSVA”算法，我们选择了四种表型（免疫相关、代谢相关、核苷和RNA相关和基质相关）进行热图展示（图2I)。这些途径包含“C2.cp.kegg”, “C2.cp.reactome”和“C2.go.bp”。通过“limma”包的分析，确定了差异途径。结果表明GAC1富集在与核苷相连的途径中。GAC2与基质和免疫功能有关。免疫和代谢性状存在于GAC3中。在此基础上，我们讨论了GAC与CMS的关系并创建了热图来显示GAC和CMS之间的关系（图3A)。令人惊讶的是，我们发现GAC1和GAC2分别与CMS2和CMS4重叠。而在GAC3患者中，CMS1和CMS3占据相等且最大的比例（图3A、B)。随后我们使用“CMScaller”包的经典途径进一步验证了这些发现。与CMS4相关的“EMT”和“TGF-Beta”途径在GAC2中富集（图3A）。我们用ssGSEA对糖酵解途径进行了量化，发现在GAC3中存在高表达（图3A、D）。此外，糖酵解与WNT、MSS、LGR5干细胞、HNF4A、CMS2和CMS4负相关，而与MSI、脂肪酸、DNA修复、CMS1、CMS3和细胞周期正相关（图3F)。GSE39582数据集的冲积图进一步证明GAC1指向CIN免疫下降和CIN Wnt-up，GAC3指向dMMR和KRASm，GAC2指向其余（图3E)。最后，GAC1共享了CMS2的大部分功能。GAC2与CMS4最相似，GAC3具有CMS1和CMS3的双重特征。

4.在scRNA-seq水平上将糖酵解相关簇映射到CRC细胞

我们通过对GSE132465数据集进行预处理，整合了23个肿瘤样本。在bulk-seq的基础上进行单个细胞GAC分类的构建。基于Lee等人的研究进行细胞类型注释（图4A)。通过使用“AddModuleScore”，将三个类似GAC的子集群映射到单个细胞（图4B)。此外，糖酵解相关基因标记（glygene）在图4C，表明其主要存在于骨髓、基质和上皮细胞中。随后我们将不同GAC簇添加到每种细胞类型中（图4E)。有趣的是，我们发现上皮细胞中GAC1簇（69%）和GAC3簇（31%）占比较多。虽然T细胞和B细胞与上皮细胞具有共同的GAC特征，但GAC3簇在这些细胞中的浓度高于GAC1样，表明其与上皮细胞不同。基质细胞几乎是GAC2簇（95%），髓样细胞中GAC2簇占65%，GAC3簇占33%。每种细胞亚型的标记基因展示于火山图中（图4D）。显然，髓系-G2中富含药物反应、DNA甲基化和谷氨酸代谢途径，而髓系-G3则相反。T细胞-G2对药物有良好的反应。B细胞-G1、2的mRNA甲基化程度较高。重要的是，我们筛选出了与预后（OS和DFS）最相关的GAC簇临床亚群，其中的标记基因用于后续GAC预测因子的分析。Meta-pool分析显示T细胞-G2、T细胞-G3、基质-G2、髓样细胞-G2和上皮细胞-G1具有重要意义，因此我们确定这五个GAC样亚群为独立的预后因素（图4G，H)。

5.上皮细胞中两个GAC样子簇的分析

在上皮细胞中，类GAC亚簇和CMS亚型的分布如图5A、B。研究发现，CMS和GAC类亚群之间的对应关系与bulk-seq的相当，表明了这种关系的稳健性。通过GO富集分析，我们发现上皮细胞-G3富集在转移特征中，而上皮细胞-G1则主要与RNA生物过程相关（图5C)。同样，通过GSVA分析，我们在两种类型的上皮细胞中显示了50个标志性特征，证明了GAC3样的厌氧性状和GAC1样上调氧化磷酸化的能力（图5E)。两种富集分析的结果显示，GAC1类上皮细胞会增殖，而GAC3类上皮细胞会入侵。此外，对两种上皮细胞亚型临床特征的研究也显示出了不同之处。在CMS亚型中，CMS2在scRNA和bulk-RNA水平上都是GAC1样，而在CMS1和CM3中发现了相当一部分GAC3样，这与之前的结果一致。就分期而言，CRC中晚期患者的GAC1样上皮细胞比例增加。在突变方面，GAC1样上皮细胞中含有大量TP53和APC突变，其他部位的突变不明显。对于MSS，大多数GAC3样细胞具有MSI-H特征（图5D)。根据拟时序分析，上皮细胞将从GAC3样转变为GAC1样（图5F)。同时，HLA-A和HLA-B主要存在于GAC3样细胞中，表明这些细胞具有更强的免疫反应倾向（图5G，H)。最后，采用细胞通讯分析研究非肿瘤细胞对肿瘤上皮的影响。Sromal-G2和骨髓-G2与上皮细胞之间的连接频率较高，但Epthelial-G3受B细胞G2的影响更大（图5I)。气泡图特别显示了配体-受体网络，从中我们可以判断SPP1-CD44在骨髓-上皮相互作用中值得注意。CD44被认为可促进结直肠癌的干性和侵袭性。MDK配体与多种受体相关，以调节基质细胞和上皮细胞之间的相互作用。GZMA-F2RL1在T细胞-G3和上皮-G3（图5J)。最后，增殖型上皮-G1和侵袭型上皮-G3均受TME调控。

6.GAC与肿瘤微环境的相关性

我们收集了两组TME细胞特征（Lee和Charoentong）进行ssGSEA分析。与scRNA水平一样，我们发现基质细胞在bulk数据中主要集中在GAC2。B细胞、骨髓细胞和T细胞聚集在GAC2和3中。上皮细胞的表达与scRNA的结果一致。值得注意的是，GAC2拥有更多的调节性T细胞（Tregs）（图6A）。在Charoentong的特征中，巨噬细胞、T细胞和B细胞的表达趋势与Lee观察到的结果相似（图6B）。Cibersort算法计算了每个细胞的表达比例。在Lee的细胞特征中，增殖性EC在TME中的比例最高，增殖性巨噬细胞次之，其中GAC2的比例分别最低和最高（图6C）。在LM细胞特征中，同样的现象也出现在巨噬细胞中，而T细胞在所有细胞中所占比例次之，在GAC2中最低。值得注意的是，GAC2中M2巨噬细胞的比例更高（图6D）。根据估算方法，GAC2和GAC3的基质和免疫评分高于GAC1（图6E）。为了预测不同GAC对免疫疗法的反应，我们收集了MSS、dMMR、TMB和PD-1信息。结果表明GAC3的MSI-High和dMMR百分比更高（图6F），TMB得分更高（图6G）。而GAC2的PD-1、PDL-1和CTLA-4表达相对较高（图6H-J）。Lee氏细胞的相关性见图6K，其中我们显示了糖酵解与每种细胞之间的关系。GAC1的免疫细胞浸润最少，GAC2有较多的基质细胞和免疫细胞，但也有很大比例的肿瘤促进细胞（Tregs、M2巨噬细胞），而GAC3有较高的免疫细胞浸润。总之，GAC1相当于免疫凋亡型，GAC2相当于免疫炎症/排斥型，而GAC3则相当于免疫激活型。

7.基因簇的鉴定和描述

我们确定了基因簇，以研究GAC之间DEGs存在的内在原因。为了得到最终的DEGs，我们对每对GAC之间DEGs求取交集（图7A）。然后将108个基因进行共识聚类，得到了三个聚类，即基因簇（图7B）。从临床特征来看，我们发现基因簇B有显著的GAC2患病率和不良预后（图7C）。图7D显示了这108个基因的聚类表达模式和其他临床特征。从富集分析来看，基因簇A的MSS和MYC上调。在基因簇B中，分化、MSI、糖酵解和脂肪酸被高度富集。基因簇C中的TGF-Beta和EMT被激活（图7E）。根据GO分析，基因簇B和C与细胞外基质合成和上皮细胞增殖有关，而基因簇A则与T细胞活化和O-糖过程有关（图7F）。我们利用两个ssGSEA特征发现，基因簇C组在大多数TME细胞中有强表达。基因簇B的免疫细胞相对活化（图7G、H）。综上所述，GACs的临床、生化和免疫学特征都得到了基因聚类的支持。

8.GAC中TMB、CNV、甲基化和CSC指数的探索

本节重点介绍肿瘤干性和基因组学的研究。我们使用瀑布图在COAD和READ中显示了每个GAC的前10个突变基因。在COAD中，GAC1和GAC2的突变相似，而在GAC3中，我们没有发现TP53的高突变率。在READ中，我们检测到FATA4的高突变率，特别是在GAC2中。APC、TP53、TTN和KRAS是突变频率最高的基因（图8A、B)。此外，我们注意到TMB评分和糖酵解评分有良好的联系，GAC3具有高水平的TMB和糖酵解属性（图8C)。同时，GAC3具有较低的拷贝数变异，表明与促肿瘤作用相反（图8D、E)。GAC1的总体甲基化低于其他两种（图8F)。通过CNV计算发现CSC指数与糖酵解评分呈正相关，GAC2占CSC指数最低（图8G，H)。综上所述，我们认为GAC1为低甲基化类型，GAC2为低CSC类型，GAC3为低CNV和高TMB类型。

9.基于机器学习的GAC预测因子构建和GAC预测因子相关基因（GP基因）的描述

我们使用四种机器学习方法为每个患者的GAC状态构建了一个预测模型。我们将TCGA称为训练集，将GEO称为验证集。整个过程显示在图9A。为了确保结果的可靠性，我们在bulk和单细胞水平上使用具有临床意义的基因进行后续分析。因此，GAC DEGs与重要细胞亚型（图4G，H）获得。为了保留对预测结果影响最大的基因，我们使用Lasso，SVM，Randomforest（Boruta）和XGBoost进行筛选。雷达图表明，4种方法在测试集和训练集中的AUC值较高。我们再次交叉了通过四种机器学习方法过滤的基因，以获得最终的基因集，称为GP基因。随后，使用GP基因进行多项式逻辑回归，构建最终的GAC预测因子。将GAC预测因子应用于验证后，在训练集和验证集中，我们获得了高水平的AUC和准确度值（训练集：AUC = 0.9984，准确率 = 0.9658；验证集：AUC = 0.9380，准确率 = 0.8114）（图9B)。我们进一步对GP基因进行了几项分析。热图显示了GP基因的表达顺序（图9C)。对GP基因进行了基因组学相关研究，包括TMB和CNV分析。我们发现EIF2S2，DPM1和ISG20作为CNV扩增，GMDS，BNIP3L和VCAN作为CNV缺失（图9D)。所有GP基因均显示在染色体环图中（图9F)。通过TMB分析，我们将VCAN，PXDN，FN1和NOTCH3鉴定为COAD和READ（图9E)。

10.用于GAC预测因子验证的每个GAC和免疫治疗队列的治疗策略

化疗和靶向药物治疗可提高晚期结直肠癌的存活率。然而，一些患者仍然几乎没有获得任何益处或产生治疗耐药性。因此，有必要为每位CRC患者制定个性化的药物治疗方案。基于三种GAC在临床和生物学上的显著差异，我们假定每种GAC都有自己合适的治疗方法，然后研究了典型化疗药物和可能的小分子药物在三种GAC中的敏感性和拮抗作用。我们使用"pRRophetic "软件包和Cmap分析对每种GAC进行了治疗预测。如图10A所示，以IC₅₀的形式得出了药物敏感性。对于GAC1，喜树碱和紫杉醇更敏感。吉非替尼和吉西他滨对GAC2的敏感性较高。Shikonin对GAC3具有更大的治疗潜力。此外，我们还进行了Cmap分析，以获取抵抗每种GAC的潜在化合物。较强的化合物功效源于较低的分数。30种化合物在图10B提供治疗策略。为了测试GAC聚类在免疫治疗队列中的作用，我们获得了两个数据集进行验证（IMVigor210和GSE78220)。在IMVigor210中应用GAC预测因子后，我们发现GAC2预后不良（p = 0.004，对数秩检验），以及免疫治疗反应（图10C，D)。在GSE78220，得出的结论相同，即GAC2的OS率不利（p = 0.128，对数排名检验）。即使GSE78220的p值不显著，每个GAC的生存模式清晰可见（图10E，F)。总体而言，我们探索了GAC的潜在化合物，并验证了GAC在免疫治疗领域的预测因子。

【声明】内容源于网络

中科生信

中科生信是一家专业从事生物技术服务的公司，提供生物医学领域的定制化数据分析服务。公司业务有：二代测序平台、数据库搭建技术、测序个性化分析平台、以及生信分析定制化服务！致力于为客户提供“一站式”科研服务。

内容 580

粉丝 0

中科生信中科生信是一家专业从事生物技术服务的公司，提供生物医学领域的定制化数据分析服务。公司业务有：二代测序平台、数据库搭建技术、测序个性化分析平台、以及生信分析定制化服务！致力于为客户提供“一站式”科研服务。

总阅读1.6k

粉丝0

内容580