7+：m6A联合m5C的lncRNA分析，可以直接拿来用的生信思路

背景：N6-甲基腺苷（m6A）和5-甲基胞嘧啶（m5C）可以修改长的非编码RNAs（lncRNAs），从而影响肿瘤的发生和肿瘤的进展。然而，关于m6A和m5C相关的lncRNAs在肿瘤微环境（TME）中的潜在作用和交叉作用及其对预后的影响还缺乏了解。作者对结直肠癌（CRC）中m6A和m5C相关的lncRNAs进行了全面分析，揭示了它们在预测肿瘤-免疫-基质微环境、临床病理特征和预后方面的潜在功能，并确定了它们在免疫治疗中的作用。

方法：

1、TCGA和GEO数据集做差异分析（lncRNA）；

2、共表达分析鉴定m6A和m5A相关基因的强相关lncRNA；

3、一致性聚类、KM生存分析和免疫浸润细胞丰度差异；

4、单因素COX、LASSO、多因素COX构建预后风险模型。

鉴定CRC中与m6A和m5C相关的lncRNAs

为了全面了解参与肿瘤发生的m6A和m5C相关lncRNA的表达模式，作者的研究整合了四个符合条件的CRC队列的1364个CRC样本，即TCGA-COAD/READ、GSE39582、GSE17536和GSE38832，进行进一步分析。作者从TCGA数据库中共提取了lncRNAs。通过共表达分析，我们分别确定了m6A和m5C相关的lncRNAs（|相关系数|>0.4，p值<0.001）。从m6A和m5C相关的lncRNAs的取共同的lncRNAs。随后，与其他三个GEO数据集获得的lncRNAs相交后，共确定了m6A和m5C相关lncRNAs的共同lncRNAs，并用于后续分析。

作者对单变量Cox回归分析得到的21个m6A和15个m5C相关lncRNAs的表达水平进行了共识的无监督聚类分析。根据累积分布函数和临床意义来确定最佳的聚类数量。作者选择k=2的值作为进一步分析的适当的聚类数。最后，确定了两个亚型，并将其称为簇A（n = 279）和簇B（n = 599）（图2B）。为了进一步检查通过共识聚类确定的两个亚型的临床病理特征，作者比较了不同亚型的CRC患者的临床病理特征。观察到两个亚型之间m6A和m5C相关lncRNAs的表达和临床病理特征有明显差异（图2C）。与集群A相比，集群B优先与年轻的年龄（P值<0.05）和较低的TNM分期（P值<0.05）有关。此外，两种亚型的预后分析显示，亚型B的患者比亚型A的患者有更长的OS（图2D）。

不同亚型的TME和TIICs的特点

为了确定这两种不同亚型的生物学意义，作者进行了GSVA富集分析。聚类A在基质和致癌激活途径中明显富集，如ECM受体相互作用、结直肠癌、TGF-β信号途径、细胞粘附和其他癌症相关途径（图3A）。群组B富集于与代谢有关的途径，包括乙醛和二羧酸盐的代谢、丙酮酸盐的代谢和药物代谢-其他酶（图3A）。

为了研究m6A和m5C相关的lncRNAs在CRC的TME中的作用，作者用CIBERSORT算法分析了这两种亚型与每个CRC样本的22种人类免疫细胞亚群之间的关系（图3B-F）。此外，作者通过ESTIMATE软件包评估了两个亚型的TME评分（基质评分、免疫评分和估计评分）。较高的基质分数或免疫分数代表TME中基质细胞或免疫细胞的相对含量较高，而估计分数表示TME中基质分数或免疫分数的聚集情况。结果显示，A组与基质分数、免疫分数和估计分数显著相关（图3G-I）。

构建与m6A和m5C相关的lncRNA预后特征

为了进一步探讨m6A和m5C相关lncRNAs在CRC中的预后价值，作者对这m6A和m5C相关lncRNAs进行了LASSO Cox回归和多变量Cox比例危险回归分析，以进一步选择一个稳健有效的风险模型来预测预后。通过LASSO回归分析（图4A）和部分似然偏差（图4B）筛选出预后相关的lncRNAs。随后，作者根据AIC值对这预后相关的lncRNAs进行多变量Cox回归分析，最终得到7个lncRNAs（图4C）。根据m6A和m5C相关预后lncRNAs的回归系数和表达水平，计算出训练集中每个病人的风险分数。用于构建高风险组和低风险组风险评分的八个基因的表达水平。分数低于风险评分中位数的患者被归入低风险组，而分数大于风险评分中位数的患者被分配到高风险组。与B亚型相比，A亚型显示出明显的风险得分增加。两个亚型和两个风险亚组的患者分布情况见图4D、E。基于签名的风险分布图显示，生存时间减少，而死亡率随着风险分数的增加而增加（图4F、G）。生存分析显示，低风险评分组患者的预后好于高风险评分组（对数秩检验，P值<0.001；图4H）。此外，随时间变化的ROC曲线显示，训练集的AUC为0.721（图4I）。

为了验证该签名的预后性能，作者计算了整个TCGA集的风险分数（图5A）。根据与训练集相同的公式，将患者分层为高风险或低风险组。生存分析显示，与高风险组相比，低风险组的预后明显更好（log-rank；p值<0.05；图5C），ROC的AUC大于0.7（图5D），表明该签名具有预测CRC患者生存的出色能力。

预后特征的临床相关性分析和分层分析

为了研究签名与CRC临床病理特征的关联，作者确定了标志物与CRC不同临床特征（年龄、性别、肿瘤位置、TNM分期、KRAS突变和BRAF突变）之间的相关性。T3-4期、N1-3期、M1期和III-IV期亚组的风险得分明显高于T0-2期、N0、M0和I-II期亚组（P值<0.05；图6A-D）。为了确定该预后特征是否可以独立预测CRC患者的预后，作者将临床特征（年龄、性别、肿瘤位置、TNM分期和KRAS突变）与预后特征的风险分值结合起来进行单变量和多变量Cox回归分析。如图6E所示。F，GEO组的年龄、TNM分期和风险评分显示出明显的差异，结果与TCGA组的结果一致（图6G，H）。

生物标志物和CSC指数与对化疗药物敏感度之间的关系

作者分析了两种亚型与CSC指数之间的相关性。如图7A、B所示，高危组和低危组的CSC指数有明显差异。特征中不同的CRC亚组应指导临床治疗。因此，作者比较了高风险组和低风险组对常见抗癌药物的敏感性，以确定潜在的CRC治疗模式。高危组的患者可能对顺铂、吉西他滨、拉帕替尼、尼罗替尼和帕唑帕尼敏感，而低危组的患者对紫杉醇更敏感（图7C-H）。在这种情况下，将来有可能采用这些药物来治疗高风险的CRC。

预测存活率的列线图

为了建立一个预测CRC患者预后的定量方法，作者建立了一个提名图来预测CRC患者的3年、5年和10年的OS。在多变量分析中所有重要的变量（年龄、分期和风险评分）都根据算法在列线图中列举出来。诺莫图显示了一个预测生存概率的病人的例子。变量分数相加得到总分，总分线显示在诺莫图的底部，它可以预测3年、5年和10年的OS概率（图8A）。作者对诺莫图模型进行了AUC实验，发现它在预测GEO和TCGA组的3、5和10年的OS时有较高的准确性（图8B，C）。校准曲线描述了GEO和TCGA中预测的3年、5年和10年生存事件与虚拟观察结果之间的预测值（图8D，E）。