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4+！基于三个免疫原性细胞死亡相关基因的非肝硬化肝细胞癌新预后模型的建立和验证
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4+！基于三个免疫原性细胞死亡相关基因的非肝硬化肝细胞癌新预后模型的建立和验证

4+！基于三个免疫原性细胞死亡相关基因的非肝硬化肝细胞癌新预后模型的建立和验证 中科生信
2023-10-04
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导读：大家好！今天小编和大家分享一篇23年9月发表在Journal of Hepatocellular Carci
大家好！今天小编和大家分享一篇23年9月发表在Journal of Hepatocellular Carcinoma（IF：4.1）杂志的文章《Development and Validation of a Novel Prognosis Model Based on a Panel of Three Immunogenic Cell Death-Related Genes for Non-Cirrhotic Hepatocellular Carcinoma》。本研究旨在利用TCGA数据集探讨免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）与非肝硬化肝细胞癌（non-cirrhotic hepatocellular carcinoma，NCHCC）预后的相关性，以及NCHCC中ICD相关基因的潜在预后价值。本研究建立了一个由三个基因组成的预后模型，可以帮助预测NCHCC患者的生存，并指导NCHCC药物和分子标记的选择。

背景
肝硬化HCC和NCHCC患者的风险因素、发病背景、临床特征、肿瘤发展、预后和监测指标各不相同。由于缺乏对NCHCC患者的监测，早期诊断NCHCC具有挑战性，这可能导致延迟治疗。在精准治疗时代，必须明确影响NCHCC预后的因素，便于临床咨询和个性化预后预测NCHCC。ICD是一种由放疗和化疗等多种抗癌治疗引起的新型细胞死亡，发生在感染细胞和恶性细胞中的受调节细胞死亡，可以通过促进损伤相关分子模式（DAMPs）的释放来激活先天和适应性免疫反应。ICD能提高肿瘤的免疫原性，促进冷肿瘤向热肿瘤转化，增强肿瘤的免疫治疗敏感性。然而，ICD相关基因在NCHCC中的功能作用及其与预后的相关性尚不清楚。本研究旨在探讨ICD在NCHCC中的功能作用及其指导肿瘤治疗反应和预测预后的能力。
 
方法
  1. 基于Ishak score（≤ 5）于TCGA数据库检索NCHCC及相应癌旁组织基因表达数据，从先前研究获取57个ICD相关基因；
  2. 利用limma鉴定DEGs，并进行GO和KEGG富集分析；
  3. 利用WGCNA鉴定NCHCC表型相关模块基因；
  4. 基于ICD相关生物标志物的表达，使用ConsensusClusterPlus包聚类分析135例NCHCC样本，利用limma鉴定不同簇间DEGs；
  5. 利用单变量和多变量COX分析构建预后模型，并绘制K-M和ROC曲线；
  6. 采用“GSVA”R包单样本基因集富集分析（ssGSEA）算法评估每位患者的免疫功能评分，并检测两组免疫检查点的表达情况。使用“reshape2”评估风险评分与免疫检查点之间的相关性，采用CIBERSORT算法评估不同风险组免疫浸润细胞的占比，采用“maftools”分析和可视化基因组数据；
  7. 预测对免疫治疗、化疗和靶向治疗的反应；
  8. 采用单变量和多变量Cox回归分析来估计预后特征对NCHCC队列预后的独立影响；
  9. 构建列线图，并使用“timeROC”和“rmda”R包绘制ROC曲线和校准曲线，以评估nomogram诊断价值；
  10. 免疫组化（IHC）和组织芯片（TMA）分析；
  11. qPCR、Western Blot、Transwell和Wound Healing分析，以及CCK8试验。
  
技术路线


研究结果
  1. NCHCC中DEGs的分析
在癌症和邻近组织之间鉴定出3167个基因差异(1809个基因上调，1358个基因下调)(图2a)。GO分析(图S2a)显示，在生物过程类别中，DEGs的富集响应于蛋白酶体蛋白分解代谢过程、有丝分裂细胞周期相变、磷酸盐代谢负调控过程、磷代谢负调控过程、蛋白质分解代谢调控过程；在细胞组分类别中，DEGs富集于细胞底物连接处、核斑点、染色体区、染色体、着丝粒区和外膜；在分子功能方面，DEGs激酶调节活性、蛋白激酶调节氧化还原酶活性、作用于配对供体、结合或减少分子氧、铁离子结合和核糖核酸酶活性等方面富集。KEGG通路分析(图S2b)显示，DEGs在细胞衰老、病毒致癌、酒精中毒、细胞周期和TNF信号通路中富集。筛选与NCHCC表型相对应的模块并鉴定交叉基因以鉴定NCHCC中的非肝硬化相关基因，TCGA-NCHCC数据集进行WGCNA(图2b-d)。选择棕色、粉色和灰色模块对应的基因进行后续分析。在对癌症相关基因、NCHCC表型相关基因和icd相关基因进行鉴定后，从Venn图中得到5个交叉基因(图2e)。

 
  1. 交叉基因的获取
基于5个交叉基因的表达谱，对135例NCHCC患者进行基于ICD相关基因的聚类分析、分子分型和预后评估共识聚类分析，结果显示两个亚型:亚型A(65例)和亚型B(68例)(图3a)。Kaplan-Meier曲线显示，A亚型患者的OS高于B亚型患者，提示A亚型与预后改善相关(Log rank检验，p < 0.001;图3b)。使用limma包确定了亚型A和B之间的186个DEGs(图3c)。147个预后相关的DEGs从癌症和邻近组织之间的亚型相关和组织相关的DEGs的交集中筛选出来(图3d)。

 
  1. 预后模型的构建与验证
基于147个预后相关DEGs利用单变量和多变量Cox回归分析以确定OS的预后因素。单变量Cox回归分析显示18个与NCHCC预后相关的因素(图4)。对这18个因素进行逐步变量多变量Cox回归分析，建立预测预后的风险评分模型。由TMC7、GRAMD1C和GNPDA1组成的小组是NCHCC患者OS的重要预测因子。风险评分计算方法如下: risk score = (1.04 × expression level of TMC7) + (−1.49 × expression level of GRAMD1C) + (2.15 × expression level of GNPDA1)。Kaplan-Meier曲线显示，低危组患者的OS高于高危组患者(图4b和c)。该模型在区分低风险组和高风险组方面表现出良好的性能。1年、2年和3年生存率的AUC值分别为0.805、0.666和0.674。如图4d-g所示，风险评分模型在验证集和总TCGA-NCHCC样本中均表现良好。

 
  1. 不同风险组人群肿瘤微环境分析
为了了解高危组和低危组肿瘤微环境的异质性，我们进行了免疫相关分析，包括ssGSEA和CIBERSORT。ssGSEA显示，高危组主要富集APC_co_stimulation、check - point、MHC_class_I和type_ii_ifn_response等信号通路(图5a和S3a)。使用CIBERSORT反卷积方法评估高风险和低风险人群中22种TIICs的相对丰度。B细胞记忆、T细胞调节性(Tregs)、树突状细胞静息、肥大细胞静息在高评分组显著增加(图5b)。对风险评分模型中每个特征基因富集的TIICs进行分析。GNPDA1的表达与肥大细胞静止比例呈正相关。同时，TMC7的表达与treg和树突状细胞静息比例呈正相关，与NK细胞活化比例负相关(图5f)。高危组免疫检查点的表达水平显著上调(图5c和S3c)。此外，24个免疫检查点基因(如TNFRSF18、NRP1和CD44)与风险评分呈正相关。高危评分组中最常见的变异是CTNNB1突变(42.9%)，其次是TP53(32.1%)和MUC16和TTN(>20%)突变。在低风险评分组中，最常见的变异是TP53突变(31.7%)，其次是TTN(25%)和CTNNB1(20%)突变(图5d)。HLA相关基因如HLA-A、HLA-DMB、HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB2、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLADRA、HLA-DRB1和HLA-DRB6在不同组间存在差异(图5e和S3d)。

 
  1. NCHCC的药物敏感性预测
长春花碱、阿西替尼、GDC-0449、甲氨喋呤、多西紫杉醇对肿瘤的IC50值在高危组显著高于低危组(图6a-e, p < 0.05)。而博来霉素、顺铂、阿霉素、艾替霉素B、吉西他滨、丝裂霉素C、巴托克拉、甲氨酸盐、索拉非尼对高危组肿瘤的IC50值低于低危组肿瘤的IC50值，提示这些预后相关基因可能影响药物对HCC的治疗效果(图6f-m, p < 0.05)。

 
  1. 预后特征的临床价值
在TCGA-NCHCC队列中，通过单变量和多变量Cox回归分析对风险特征和其他常见预后因素的独立预测能力进行评估，发现风险评分和肿瘤分级与NCHCC的预后相关(图7a和b)。亚组Kaplan-Meier曲线显示，与低危评分组相比，高危评分组在疾病早期和中期的预后较差(图7c-g)。在M0、T1和N0肿瘤中观察到类似的模式。这些结果表明，相同临床分期的非chcc患者可能表现出不同的预后。本研究建立的风险评分模型可用于区分预后不良的患者，优化治疗方案，从而改善预后。

为了预测1年和3年生存的概率，构建了包含年龄、分期和风险评分的列线图(图8)。采用ROC曲线评价列线图诊断价值(图8b)。1年和3年生存的列线图AUC值分别为0.799和0.737。这些结果以及校准曲线证明了列线图的有效诊断价值(图8c)。

 
  1. TMC7和GRAMD1C对肝癌细胞恶性生物学行为的影响
为了评估TMC7和GRAMD1C在肝脏癌细胞迁移、侵袭和增殖中的作用，在HepG2和Huh7细胞系中使用siRNA敲低TMC7和GRAMD1C。使用qRT-PCR和Western blotting分析证实了siRNA的敲低效率(图9a-c)。使用CCK8、transwell和wound healing检测TMC7和GRAMD1C敲低对HCC细胞恶性行为的影响。如图9d和图e所示，TMC7敲低的HCC细胞的迁移能力显著下调，而GRAMD1C敲低的HCC细胞的迁移能力显著上调。transwell实验结果显示，TMC7敲低显著抑制肿瘤细胞侵袭，而GRAMD1C敲低显著增强肿瘤细胞侵袭(图9f和g)，TMC7和GRAMD1C不影响HepG2和Huh7细胞的增殖(图9h和i)。

TMC7和GRAMD1C在NCHCC组织及相应肿瘤邻近组织中的表达水平采用免疫组化分析检测。肿瘤组织中TMC7表达上调和GRAMD1C表达下调 (图10a和b)。TMC7的表达上调和GRAMD1C的表达下调可以预测NCHCC患者预后不良(图10c和d)。



 

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中科生信是一家专业从事生物技术服务的公司，提供生物医学领域的定制化数据分析服务。公司业务有：二代测序平台、数据库搭建技术、测序个性化分析平台、以及生信分析定制化服务！致力于为客户提供“一站式”科研服务。
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