5+：DNA甲基化联合转录组，高分文章也能轻松拿捏

背景&方法

Zhong Ke Sheng Xin

背景：后颅窝室管膜瘤（EPN-PF）可根据DNA CpG岛甲基化谱状态和基因表达分为A组后窝室管膜瘤（EPN-PFA）和B组后窝室管膜瘤（EPN-PFB）。EPN-PFA 通常发生在 5 岁以下儿童中，预后较差。

方法：

1、EPN-PF相关DEGs和DMGs联合分析；

2、GO和KEGG通路分析和PPI分析；

3、WGCNA分析和枢纽模块的识别；

4、EPN-PF相关 hub DMGs的识别；

5、免疫组化法检测EPN-PF相关hub-DMGs表达；

6、GSVA通路富集分析。

结果

Zhong Ke Sheng Xin

数据概览

作者从GEO数据库下载了两个微阵列数据集。数据集（GSE66354）包括手术肿瘤和正常脑样本（n = 149）的基因表达谱，其中包含EPN-PFA（n = 29）和EPN-PFB（n = 26）。此外，数据集（GSE114523）中包括了43名EPN-PFA和12名EPN-PFB患者的DNA甲基化谱。

EPN-PF相关DMGs的鉴定

通过分析GSE66354数据集，两个EPN-PF亚型之间的共发现1337个差异基因（图b），其中712个基因上调，625个基因下调。图a中为top10的上调和下调基因的表达情况。通过分析GSE114523数据集，作者共发现1873个高甲基化基因和1164个低甲基化基因（图c）。然后高甲基化基因与下调基因取交集，低甲基化基因与上调基因取交集，最终得到63个甲基化相关高表达基因，83个甲基化相关低表达基因（图d）。

GO和KEGG通路富集及PPI分析

为了进一步研究参与疾病发生和发展的生物学功能和信号通路，作者通过GO，KEGG和PPI分析了甲基化相关高表达基因和甲基化相关低表达基因。GO富集所示，EPN-PF相关DMG在细胞外基质组织，适应性免疫应答和膜筏方面显着丰富（图a）。此外，KEGG通路富集结果显著富集到局灶性粘附，NF-kappa B等通路。通过PPI网络分析，作者得到了两个重要的模块（图b，d）。

WGCNA分析和枢纽模块的识别

样本聚类发现GSM1620246这一个离群样品，需要从后续分析中删除（图a，b）。随后，我们将剩余的54个样本纳入WGCNA分析，软阈值确定为9，最终得到9个模块（图c，d）。其中，蓝色模块与EPN定位高度相关（图e）共包含805个基因。作者还发现蓝色模块与横坐标上基因表达谱之间的相关性，以及纵坐标上基因与肿瘤组的相关性（图f）。结合两个坐标，作者确认了蓝色模块中的GS和MM之间存在非常显著的相关性，然后选择蓝色模块中的180个中心基因进行后续分析。

此外，作者还将甲基化相关高表达基因、甲基化相关低表达基因和蓝色模块基因取交集，确定了五个基因为EPN-PF相关中枢DMG：ATP4B，CCDC151，DMKN，SCN4B和TUBA4B（图a-g），并验证了这5个基因在不同组间的表达差异。

免疫组化验证EPN-PF相关中心DMG的表达

使用IHC测定法检测上述获得的DMG的表达水平，以验证结果的可靠性。首先，我们确定了我们获得的肿瘤的亚型。与EPN-PFB相比，EPN-PFA的ATP4B、CCDC151、DMKN和SCN4B水平均有所下降，与预测一致。除SCN4B外，其他三者的差异均有统计学意义（P<0.05）（图a-d）。

GSVA通路富集分析

为了探索在免疫细胞浸润中发现的关键分子的作用，作者评估了EPN-PF样品两种亚型中28种免疫浸润细胞的差异。如图a所示，两种亚型之间的免疫细胞存在显著差异。同时Spearman相关性分析揭示了这些基因与免疫浸润细胞之间的显著相关性（图b），可以直接看到TUBA4B与浆细胞样树突状细胞（pDC）表现出显著的正相关；SCN4B，DMKN和CCDC151与T细胞浸润表现出显著的负相关；ATP4B与趋化因子受体（CCR）表现出显著的负相关。

接下来，作者使用GSVA来确定这五个基因中富集到的通路。作者发现几种与肿瘤发生，发育和预后相关的重叠且显着不同的途径：PI3K-Akt-mTOR，TNFα-NFKB和缺氧（图a-e）。

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