今天小编和大家分析一篇2024年1月发表在《Chinese Medical Journal》（IF:6.1）期刊上的文章《A genetic variant in the immune-related gene ERAP1 affects colorectal cancer prognosis》。
背景：
尽管近年来肿瘤治疗手段不断改进，但在中国，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的死亡率仍在持续上升。目前临床治疗策略主要依赖于肿瘤-结节-转移分级系统，然而，同一肿瘤分期的患者在接受类似治疗后的个体反应可能存在差异，这提示了鉴定新的临床生物标志物以准确预测CRC患者预后并指导CRC个性化治疗的重要性。迄今为止，越来越多的研究报道单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs）与包括CRC在内的各种肿瘤的进展相关。一些SNPs被报道与药物处置、药代动力学效应和宿主免疫相关，进而影响药物反应和生存结果。表达定量性状位点（expression of the quantitative trait locie，QTL）图谱将遗传变异与基因表达联系起来，可作为一种有效的中间工具，填补从基因型到人类表型之间的空白。在本研究中，我们通过进行两阶段的群体分析，证实了CRC存活率与eQTLs 之间的关系。
方法：
1，CRC中的全基因组eQTL分析
2，鉴定与CRC存活相关的eQTL基因
3，识别潜在的功能性SNP、CRC样本的SNP基因分型
4，功能实验验证
研究结果：
（一）7个潜在功能性SNP调控的6个基因的表达与CRC预后相关
为了确定与CRC预后相关的eQTL，首先利用TCGA数据进行了全基因组系统eQTL分析。FDR-P<0.05的SNP-基因对有3069对，其中361个eQTL靶基因与eQTL SNP密切相关（| r| >0.3）。然后保留与CRC患者OS相关的基因，并考虑对相应的SNP进行功能预测。Kaplan-Meier生存分析发现，在TCGA和GEO数据集中，有230个基因与CRC的生存结果有一致的相关性（P＜0.05）。在这230个基因中，有6个基因（LARS2、PSRC1、TFB1M、TTC12、ERAP1和RNF157）是eQTL靶基因。结果显示，这些基因的表达量越低，表明 CRC 患者的OS越短（图1）。
根据eQTL分析，6个生存相关基因的表达与 46 个 eQTL 相关。为了确定最具潜力的功能性SNPs，考虑了与这些eQTLs处于LD（r2>0.2，n=784）的所有SNPs。功能预测表明，7个SNPs（小等位基因频率≥0.05，rs12088168、rs13074123、rs34750、rs1334688、rs7107223、rs74254475、rs71630754）具有最高的功能潜力，其中两个独立的SNPs（rs34750和rs71630754）位于ERAP1基因。至于 3′-UTR 区域的SNPs，TargetScan 预测的目标基因与eQTL分析结果均不一致。因此，只将这7个SNP作为中国人群研究的候选变异。
（二）rs71630754 与 CRC 预后有关
为证实 SNP 与患者预后之间的关系，进行了人群分析。研究共收集了907 名中国CRC患者的预后信息，在这些患者中，有383人死于CRC，男性和女性患者的中位生存时间在统计学上没有显著差异。年龄越大和癌症分期越晚的患者预后越差。在7个候选SNP中，Cox回归结果显示（表1），rs71630754与CRC生存率显著相关，且A等位基因患者的生存时间少于G等位基因患者。rs71630754与CRC患者生存期的关系在英国生物库队列中得到了进一步验证。然后，我们进行了分层分析，以确定rs71630754与CRC生存之间的关系。在女性、Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期亚组患者中，观察到该SNP与CRC较差的预后之间存在明显的关联。
（三）验证rs71630754的调控功能
Haploreg和CistromeDB数据库的功能预测显示 rs71630754 位于增强子区域，通过3D Genome Browser数据库中的高通量染色体构象捕获（Hi-C）数据进一步证实了这一结果，数据显示 rs71630754 与 ERAP1 启动子之间可能存在相互作用（图2）。一些研究的ChIP-Seq数据也验证了rs71630754的增强功能，它位于乙酰化组蛋白3赖氨酸 27（H3K27ac）或组蛋白3赖氨酸4单甲基化（H3K4me1）的组蛋白标记中。此外，GTEx数据还显示，与rs71630754-G等位基因携带者相比，rs71630754-A等位基因携带者在结肠组织中的ERAP1表达量较低，这与TCGA数据集中的eQTL结果一致（图3A）。此外，我们发现在TCGA数据集中，III/IV期患者的ERAP1基因表达量明显低于早期患者，在GSE39582中也显示出同样的趋势，这进一步证实了ERAP1表达量与较差的生存预后之间的关联。
随后进行了几项功能测定，以评估该变异的功能。首先进行了荧光素酶报告实验来证实rs71630754对基因表达的调控作用，结果表明，当rs71630754-A等位基因插入报告基因下游时，在HCT116和SW480细胞系中都会导致ERAP1表达量降低（图3B），这模拟了SNPs和ERAP1启动子区域的真实位置。鉴于调控区基因变异的等位基因特异性活性可能通过影响转录因子（TFs）的不同结合亲和力而发挥作用，在HCT116和SW480细胞系中进行了EMSA实验，结果显示突变等位基因比G等位基因与核蛋白的结合亲和力更强。随着未标记的 rs71630754 突变体探针数量的增加，标记探针与核蛋白的结合带逐渐减少（图4A）。为了进一步确定受影响的特定TF，我们利用 JASPAR 数据库进行了预测，数据显示 rs71630754 与 TCF3 的结合序列一致（图4B）。
TCF3是一种转录抑制因子，可以干扰转录起始复合物的形成并调控靶基因的表达。利用TCGA肿瘤样本的基因表达数据进行相关性分析，发现TCF3与ERAP1的表达呈反向相关（图4C）。此外，在两个CRC细胞系中进行的超移 EMSA 实验也证实了预测结果，随着 TCF3 抗体的增加，标记的探针-核蛋白复合物明显减少（图4D）。在超移位EMSA实验中，抗体-蛋白质-DNA复合物没有出现超移位条带，这可能是由于抗体阻断了DNA-蛋白质复合物的形成，也可能是由于抗体-蛋白质-DNA复合物的分子质量相对较高，无法在实验时间内移位显示在条带上。因此，我们证实rs71630754-A等位基因可以增加转录因子TCF3的结合，从而降低ERAP1的表达。
（四）ERAP1与CD8+ T细胞的功能有关
由于文献综述显示ERAP1与免疫过程有关，探讨了ERAP1与免疫细胞浸润的关系。首先使用 CIBERSORT 算法计算了肿瘤组织中 22 种免疫细胞的浸润情况。然后，计算了ERAP1与每种免疫细胞类型的比例以及免疫细胞标记基因之间的相关性。相关性分析发现，ERAP1 与 CD8+ T 细胞的相对比例相关（TCGA：R = 0.155，P = 0.0417；GSE39582：R = 0.092，P = 0.0497），而 CD8+ T 细胞具有肿瘤杀伤细胞的功能。利用 TCGA CRC患者中的TIMER进一步证实了ERAP1与CD8+ T细胞的关系（R = 0.327，P <0.001）。
ERAP1与CD8+ T细胞的关系还得到了以下结果的证实：CD8+ T细胞的7个标记基因，包括CD8亚基α（CD8A）、天然杀伤细胞颗粒蛋白7（NKG7）、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体（TIGIT）、CD2分子（CD2）、 T细胞受体复合物的CD3δ亚基（CD3D）、T细胞受体复合物的CD3ε亚基（CD3E）和T细胞受体复合物的CD3γ亚基（CD3G）与ERAP1显著相关，这在TCGA和GSE39582数据集中是一致的（图5A，5B）。
