7+IPF-scRNA-seq和转录组分析- 大数跨境

中科生信

2022-03-31

导读：本次小编分享一篇2022年2月4日发表于Front Immunol的文献，题目为《S100A12 as Bi

本次小编分享一篇2022年2月4日发表于Front Immunol的文献，题目为《S100A12 as Biomarker of Disease Severity and Prognosis in Patients With Idiopathic Pulmonary Fibrosis》，影响因子7.561。在本研究中，使用了Gene Expression Omnibus (GEO)数据库中的公开数据集来评估S100A12与肺功能之间的关系，以及S100A12在IPF患者中的作用。

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摘要：

背景：特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种预后较差的间质性肺病(intertial lung disease, ILDs)。S100钙结合蛋白A12 (S100A12)已被报道为IPF的预后血清生物标志物，但其与IPF的相关性在肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)中尚不清楚。

方法：数据集收集自基因表达综合(GEO)数据库。采用人相关系数、Kaplan-Meier分析、Cox回归分析、功能富集分析等方法。单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析也用于探讨S100A12及其相关基因在IPF中的作用。

结果：S100A12主要在单核细胞中高表达，经scRNA-seq和转录组分析，在IPF患者肺中表达下调。而S100A12在IPF患者的血液和BALF中表达均上调。此外，根据蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络，发现10个基因与S100A12相互作用，并根据hTFtarget数据库，发现前四个转录因子(transcription factor, TF)靶向这些基因。S100A12中两个最显著的共表达基因是S100A8和S100A9。3个基因与IPF患者肺功能呈显著负相关，与IPF患者肺St. George’s Respiratory Questionnaire (SGRQ)评分呈正相关。并且，这3个基因的高表达与BALF中较高的死亡率、血液中较短的无移植生存期(TFS)和无进展生存期(PFS)时间相关。在IPF患者中，S100A12的预后预测价值优于S100A8和S100A9，复合变量[S100A12 + GAP指数(性别、年龄、生理指标)]可能是一个更有效的预测指标。

结论：这些结果提示S100A12可能是IPF患者有效的疾病严重程度和预后的生物标志物。

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结果：

数据集预处理：

图1.本研究工作流程。

S100A12在间质性肺病(ILDs)患者中的表达：

根据国家生物技术中心信息数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6283)， S100A12主要在人的骨髓中表达。正常受试者的RNA测序(RNA-seq)和蛋白质组学数据显示，根据lungMAP数据库，S100A12在成人肺免疫细胞和间质细胞中高表达。为了探究S100A12在ild中的表达，我们从GEO数据库中提取了21个数据集。结果显示，IPF患者肺中S100A12表达显著下调，而血液和BALF样本中S100A12表达显著上调，尤其是在预后不良的患者中(图2)。与对照组相比，非特异性间质性肺炎(NSIP)、系统性硬化症相关性肺间质性肺病(SSc-ILD)和呼吸性细支气管炎相关性肺间质性肺病(RB-ILD)患者的肺S100A12显著下调。而S100A12在结节病患者中并没有很好的差异。

图2.IPF患者肺组织、BALF及血液中S100A12的表达

S100A12的Partners和TFs：

根据STRING数据库，发现10个蛋白编码基因(S100A8、S100A9、RELA、MAPK3、AGER、APP、NFKB1、HMGB1、SAA1和MAPK1)与S100A12相互作用(图3A)。基于MEM数据库，根据数百个数据集，S100A8和S100A9是S100A12最显著的共表达基因(图3B)。根据hTFtarget数据库，选取S100A12和10个相互作用基因的前4个TFs (PPARG、NR4A1、RUNX1、SCRT1)进行进一步研究(图3C)。根据GO和KEGG分析，S100A12和10个基因与NF-kappaB转录因子活性、RAGE受体结合、MAP激酶活性、IL-17信号通路、B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路显著相关(图3D)。通过查阅PubMed发表的文献，在图3E中总结了S100A12的潜在机制。同时也显示了潜在的上游和下游基因。

图3.s100a12相关Partners和TFs。

共表达分析与差异表达分析：

在IPF患者中进行S100A12与上述基因的Spearman相关性分析(图3F)。在BALF中，7个基因(S100A8/9、AGER、SAA1、TLR2、ICAM1和NLRP3)与S100A12呈正相关，PPARG与S100A12呈负相关。肺组织中，11个基因(S100A8/9、NFKB1、TLR4、TLR2、VCAM1、ICAM1、TGFB1、NLRP3、NR4A1、PPARG)与S100A12呈正相关。血液中有9个基因(S100A8/9、MAPK1/3、TLR4/2、ICAM1、NLRP3和PPARG)与S100A12呈正相关。结果表明，S100A8/9、TLR2、ICAM1和NLRP3是3个组织中与S100A12最显著相关的基因。此外，根据R包“Limma”对IPF患者和对照组进行差异表达分析(图3G)。在BALF中，S100A12、S100A9、TLR2和NLRP3显著上调，而IL17C、TNF和RUNX1显著下调。肺组织中S100A12、S100A8/9、MAPK3、AGER、ICAM1、PPARG显著下调，VCAM1显著上调。在血液中，S100A12和S100A8/9显著上调。这些结果表明，S100A8和S100A9是与S100A12相关的共表达基因最多的，我们将其纳入进一步研究。

基因与肺功能或SGRQ评分的相关性：

在GSE32537数据集(肺组织，图4)中，S100A12、S100A8和S100A9与FVC%预测值和Dlco%预测值显著负相关，与SGRQ评分显著正相关。GSE47460数据集(肺组织)由两个平台组成:GPL14550和GPL6480。这两个队列证实了S100A12与肺功能显著负相关，并发现这3个基因也与预测的FEV1%显著负相关(图4)。然而，在血液数据集中，S100A12与肺功能不存在显著相关(图4)。S100A12与S100A8、S100A9的相关性更显著。

图4.3个基因(S100A12、S100A8、S100A9)与IPF患者肺功能或肺和血液中SGRQ评分的相关性

Prognosis-Related分析：

如前所述，根据基因的最佳截点值将IPF患者分为两组。在血液中(GSE27957和GSE28042)， S100A12或S100A8或S100A9高表达的患者与低表达的患者相比，TFS(无移植生存时间)显著缩短(图5A、曲线下面积(AUCs)显示S100A12对TFS的预测值略高于S100A8和S100A9(图5A, B)。由于GSE27957数据集(血液)中死亡患者均为男性，综合预后指标的结果可能难以评估。基于GSE28042数据集(血液)，模型(S100A8/9/12 +年龄+性别)的预测值优于单一指标(图5B)。此外，在GSE93606数据集(血液，图5C)中，S100A12、S100A8、S100A9和GAP指数(性别、年龄和生理指数)与PFS(无进展生存期)呈显著负相关。从AUC来看，由S100A12和GAP组成的模型比由S100A9和GAP组成的模型具有更好的预测价值(图5C)。在BALF中，与S100A8、S100A9和GAP相比，S100A12对死亡率有更好的预测价值(图6A-C)。通过ROC曲线分析，认为S100A12与GAP组成的模型是更有效的死亡率预测模型(图6A-C)。

图5.K-M分析及S100A12、S100A8、S100A9和GAP指数对IPF患者血液中TFS和PFS的预测价值。

图6.根据GSE70866数据集进行K-M分析及S100A12、S100A8、S100A9和GAP指数对IPF患者BALF生存期的预测价值。

功能分析：

为了揭示S100A12的潜在生物学功能和相关通路，我们对S100A12高、低表达患者进行了DEGs的GO富集和KEGG通路分析[|logFC| >1和FDR <0.05]。IPF患者3个组织中，显著的GO term和KEGG通路主要富集在中性粒细胞活化、免疫受体活性、炎症反应调控、RAGE受体结合、IL-17信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、nod样受体信号通路，趋化因子信号通路。这些结果与GSEA分析一致。

此外，ssGSEA分析显示，S100A12高表达患者更易出现树突状细胞(DCs)、M1巨噬细胞、中性粒细胞、调节性T细胞(Treg)、细胞因子-细胞因子受体(CCR)、炎症反应、与肺部低表达S100A12患者相比，T细胞衰竭(图7)。在BALF中，S100A12高表达也与炎症反应评分较高显著相关。有趣的是，在血液中，S100A12高表达的患者更容易出现B细胞、CD8 T细胞、Th1细胞、Th2细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor浸润淋巴细胞，TIL)和检查点得分较低的情况。这些结果表明，S100A12与炎症过程显著正相关，S100A12的高表达可能与免疫活性降低有关。此外，CIBERSORT分析证实S100A12与3个组织的炎症过程显著正相关。

图7.GSE47460 (GPL14550) (A)、GSE47460 (GPL6480) (B)、GSE32537数据集中S100A12高表达和低表达患者的肺ssGSEA评分比较(C)。

scRNA-seq分析：

选择两个scRNA-seq数据集[GSE135893 (IPF = 12, control = 10)和GSE122960 (IPF = 4, control = 4)]。S100A12和AGER主要在单核细胞和肺泡上皮1型细胞(AT1细胞)中高表达(图8A-C)。S100A8和S100A9主要在单核细胞和巨噬细胞中表达(图8A-C)。NFKB1主要在树突状细胞中表达，SAA1主要在BPIFB1+/MUC5B+俱乐部细胞中表达，PPARG主要在肺泡巨噬细胞(AMs)中表达(图8A)。此外，IPF患者的单核细胞中S100A12、S100A8、S100A9的表达显著下调，AT1细胞中AGER的表达也显著下调(图8D)。有趣的是，S100A8和S100A9在IPF巨噬细胞中表达上调。根据对IPF患者和对照组中S100A12 >单核细胞的DEGs进行的GO和KEGG分析，IPF患者中S100A12 >单核细胞可能与抗原加工和呈递更相关(图8E)。有趣的是，在GSE135893数据集中观察到单核细胞的过渡状态，在IPF患者中过渡单核细胞S100A12的表达下调(图8C)。