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5+C5aR1在高级别浆液性卵巢癌中的预后价值

5+C5aR1在高级别浆液性卵巢癌中的预后价值 中科生信
2023-11-25
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导读：晚上好！今天小编和大家分析一篇23年9月发表在Oncoimmunology（IF:5.6）杂志的文章《C5a
晚上好！今天小编和大家分析一篇23年9月发表在Oncoimmunology（IF:5.6）杂志的文章《C5aR1 blockade reshapes immunosuppressive tumor microenvironment and synergizes with immune checkpoint blockade therapy in high-grade serous ovarian cancer》。高级别浆液性卵巢癌（HGSC）对靶向 PD-1/PD-L1 单药治疗的免疫检查点阻断 （ICB） 反应适中，被M2极化肿瘤相关巨噬细胞 （TAM） 和调节性 T（Treg）细胞密集浸润。补体 C5a/C5aR1 有助于实体瘤中 TAM 免疫抑制表型的编程，是治疗HGSC的有前途的免疫调节靶点。作者旨在确定 C5aR1在HGSC的预后、免疫微环境和免疫治疗反应中的相关性。采用免疫组织化学和流式细胞术检测C5aR1在训练组(n = 120)和新鲜HGSC组织(n = 36)中表达及与肿瘤浸润免疫细胞的关系。异种移植物的转录组学分析描绘了驱动 PMX53（一种口服生物可利用的 C5aR1 抑制剂）免疫调节活性的机制。在离体肿瘤培养物和癌症基因组图谱（TCGA） 数据集中证实了治疗相关性。C5aR1独立表达预测预后不佳，并与 HGSC 的免疫逃避亚型有关，其特征是促肿瘤细胞（Treg 细胞、M2 极化巨噬细胞和中性粒细胞）浸润增加和 CD8T 功能受损。PMX53 在多种肿瘤类型中拮抗皮下肿瘤生长，调节免疫抑制机制并与PD-1协同作用。单细胞RNA-seq分析显示，在TAMs中C5aR1主要表达，在C5aR1TAMs中具有免疫抑制相关表达特征。此外，C5aR1和PD-L1的组合与特定的分子特征和匹配的临床反应相关。因此，C5aR1的丰度可以预测HGSC的不良预后，并且加入PD-L1可能作为一种新型的预测生物标志物来指导治疗选择。
背景
免疫疗法彻底改变了癌症治疗，然而，其在卵巢癌临床环境中的疗效仍然有限。研究结果表明，免疫单药治疗卵巢癌的客观缓解率仅为10%左右，远低于黑色素瘤和淋巴瘤。疗效不佳可能是由于肿瘤异质性、存在阻止T细胞再激活的免疫抑制信号以及免疫抑制性髓系细胞的积累。因此，正在深入研究逆转效应细胞免疫抑制压力的联合疗法。此外，还需要确定可以预测免疫疗法在卵巢癌中的疗效的分子标志物，以筛选合适的免疫治疗人群。
补体 C5a 通过激活骨髓细胞（如巨噬细胞、单核细胞、DC 和中性粒细胞）中的 C5a 受体1（C5aR1）发挥免疫调节功能。C5a-C5aR1信号转导经常重塑免疫抑制性肿瘤微环境，并通过分子和细胞事件增加癌症进展的可能性。最近的研究已经确定了 C5a-C5aR1 信号转导通过诱导生物活性分子（包括 IL-1β、IL-6 和 TNF-α）对肿瘤相关免疫反应的贡献。此外，C5aR1和toll 样受体（TLR） 之间的串扰增强了自然杀伤和自然杀伤 T 细胞产生 TNF-α 和 IFN-γ。C5aR1阻断还损害肿瘤生长，并减少髓源性抑制细胞（MDSC）募集到肺癌小鼠的肿瘤中。尽管 C5aR1 对抗肿瘤免疫反应的影响已在几种人类实体癌中报道，但很少有研究涉及其对卵巢癌的影响。C5a-C5aR1 信号转导的激活也被证明具有预后作用。C5aR1 在非小细胞肺癌中的过表达预示着预后不良。在乳腺癌中，C5aR1 表达与更大的肿瘤尺寸、更高的增殖率、淋巴结转移的存在和晚期临床分期有关。相应地，C5aR1阳性乳腺癌患者的生存率低于C5aR1阴性乳腺癌患者。C5aR1表达也与胃癌患者的预后有关，肝癌尿路上皮细胞癌和肾细胞癌C5aR1 高表达患者的总生存率较低。然而，C5aR1在卵巢癌中的预后价值尚未完全阐明。
在这篇探究中，确定了C5aR1表达在高级别浆液性卵巢癌（HGSC）患者中的预后价值。在临床模型中，C5aR1阻断为免疫介导的肿瘤排斥反应提供了更宽松的环境，因此，其与抗PD-1抗体的结合协同启动了细胞毒性活性。此外，scRNA-seq分析揭示了C5aR1巨噬细胞的特征并跟踪了细胞间通讯信号。最后，整合了基因组和转录组数据，通过C5aR1和PD-L1提出了潜在的治疗方案，研究结果基于 C5aR1 和PD-L1表达的 HGSC ，对它预测对免疫检查点阻断和分子靶向治疗的反应的潜力。
方法
1.患者和标本收集 道德批准和参与同意
2.免疫组化和评估
3.多肽阻断实验
4.单细胞悬液的制备
5.新鲜肿瘤外植体培养物诊断模型的构建
6.流式细胞术
7.动物实验
8.单细胞RNA-seq分析
9.外部数据源和计算分析
10.统计分析
研究结果
1.C5aR1 表达与 HGSC 的不良结局相关
为了研究 C5aR1 在 HGSC 中的临床意义，应用Kaplan-Meier曲线和对数秩检验来比较高和低 C5aR1 亚组之间的总生存期 （OS）。在 Discovery 和 TCGA 队列中，C5aR1 的较高表达与不良预后相关（风险比 [HR] = 2.790,95% 置信区间 [CI]1.029–3.709，P = 0.012，HR = 1.642,95% CI，1.150–2.344，P =0 .002）（图1a，b)。多因素Cox回归分析表明，C5aR1可能是Discovery和TCGA队列中OS的潜在独立预后因素。在多变量分析中，PD-L1 的表达与良好的预后相关（图1c).为了进行系统的综合评估和定量分析，利用固定效应模型对HGSC进行了多项独立研究。合并结果表明，较高的 C5aR1 表达与较差的预后相关（HR = 1.73,95% CI：1.50–2.00，P < 0.001）（ 图1d，补充表S5）。总之，C5aR1的较高表达可能与不良结局有关。

 
2.C5aR1 表达与 HGSC 中的免疫抑制肿瘤微环境相关
研究了C5aR1在肿瘤微环境中的作用，它在临床结局和免疫治疗反应中起着重要作用。在 Discovery 队列中使用 IHC 评估肿瘤相关免疫细胞和效应分子。首先，使用确认 C5aR1 抗体的特异性，并表明与仅抗 C5aR1 抗体载玻片相比，肽封闭载玻片上的染色强度降低（补充图 S3A）。此外，探索了人类蛋白质图谱的数据，以验证 mRNA 和蛋白质之间的相关性（使用相同的C5aR1 抗体染色）。mRNA和蛋白质水平之间存在很强的正相关关系，这表明mRNA表达的变化可能反映在蛋白质丰度上，并进一步证实了抗C5aR1抗体的特异性（补充图S3B-C）。正如预期的那样，高C5aR1表达与 Treg 细胞、M2 极化巨噬细胞、中性粒细胞、IL-10 和 TGF-β 表达增加相关（图2a).同时，观察到TCGA队列中C5aR1表达与T细胞功能障碍特征评分呈正相关19 (图2b).同样，C5aR1 高表达的肿瘤上调了 TGF-β 和 IL-10 通路中涉及的信号通路的表达（图2c).此外，还研究了高和低 C5aR1 亚组中 CD8 T 细胞的功能表型。值得注意的是，在C5aR1高表达的肿瘤中，效应分子GZMB的表达增加，而CD8 T细胞中的免疫检查点PD-1和CTLA-4略有降低。一致地，C5aR1高表达的肿瘤上调了TGF-β和IL-10的表达，TGF-和IL-10是免疫抑制细胞因子，可促进肿瘤免疫逃逸并驱动免疫治疗耐药性。流式细胞术分析还表明，在C5aR1高表达的肿瘤中存在更多的Tregs和CD206巨噬细胞，而在C5aR1低表达的肿瘤中存在更多的HLA-DR巨噬细胞（图2d).一致地，还发现高 C5aR1 表达与免疫细胞之间存在正相关，包括记忆 B 细胞、CD8 T 细胞、滤泡辅助性 T 细胞 （Tfhs）、活化的 NK 细胞、M2 极化的巨噬细胞、活化的肥大细胞和中性粒细胞通过使用 CIBERSORT 算法（图2e).总之，这些结果表明C5aR1可能与免疫抑制性肿瘤微环境的建立有关。

 
3.抑制C5aR1延缓肿瘤生长，重新激活抗肿瘤免疫
为了研究体内 C5aR1 抑制的治疗效果，将 HM1 细胞皮下植入同基因 B6C3F1 小鼠体内，并在植入后2天（每两天）开始施用 PMX53（一种C5aR1拮抗剂），（图3a).PMX53显著改变肿瘤生长动力学，抑制肿瘤生长（图3b，c).用 PMX53 处理导致颗粒酶 BCD8T 细胞、M1 极化巨噬细胞的百分比增加，而 IL-10Tregs 和 PD-1CTLA-4CD8T 细胞（图3d).PMX53处理和未处理小鼠的差异表达分析鉴定出457个显著基因（调整后的P值<0.05，log2>0.5）（附表S6）。许多免疫相关基因在 PMX53 处理的小鼠中下调，包括趋化因子（Cxcl2 和 Cxcl13）和 TCR 信号通路的关键节点（Lck、Lat 和 Zap70），22,23而凋亡基因（Deptor、Perp 和 Sfn）在 PMX53 处理的小鼠中上调 （图3e).此外，观察到与 PMX53 处理的小鼠（图3f).为了进一步破译PMX53对HGSC标本肿瘤免疫微环境的影响，生成了HGSC新鲜肿瘤外植体培养物。在离体HGSC模型中，PMX53处理后观察到相同的结果，颗粒酶BCD8T细胞和M1极化巨噬细胞的百分比升高，PD-1CTLA-4CD8T细胞和IL-10 Treg细胞的百分比降低（图3g).总体而言，这些数据表明，C5aR1可能是通过重塑HGSC的免疫抑制肿瘤微环境来重振抗肿瘤免疫的潜在靶点。


4.抑制C5aR1增强抗PD-1免疫治疗的抗肿瘤疗效
鉴于 C5aR1 赋予免疫抑制性肿瘤微环境，假设 C5aR1 表达升高可能与免疫检查点阻断疗法（ICB）耐药性有关。根据这一假设，C5aR1 表达与两组基因呈正相关，包括肿瘤免疫功能障碍和先天抗 PD-1 耐药 （IPRES） (图4a).进一步评估了 C5aR1 表达在 HGSC 新鲜肿瘤外植体培养物免疫治疗中的临床意义。与C5aR1高表达的HGSC相比，抗PD-1抗体治疗增加了C5aR1低表达肿瘤中颗粒酶B、IFN-γ和双阳性（颗粒酶BIFN-γ）CD8T细胞的比例（图4b).有趣的是，PMX53 通过增强 CD8 T 细胞的细胞毒性活性（图4c).此外，研究了C5aR1 在三个公开的 ICB 治疗队列中预测 ICB 治疗反应的临床结果的能力。根据 C5aR1 的中位表达将患者分为两组。MIBC 患者对 C5aR1 高（图4d).与C5aR1高表达的患者相比，C5aR1低表达的患者对ICB治疗表现出良好的生存结果，无论肿瘤类型或含ICB的方案如何（HR = 0.71，合并队列的P = 0.007）（图 4w，f).C5aR1可作为 ICB 治疗临床益处的标志物，以及增强 ICB 敏感性的潜在治疗靶点。

 
5.C5aR1 主要在巨噬细胞上表达，并有助于免疫抑制表型
为了检查 C5aR1 的细胞来源，分析了来自 HGSC 的五个活检的公开可用的 scRNA-seq 数据质控和排除间歇效应后，分析40218个单细胞，聚类为8个群体（图5a).使用细胞特异性标记物，鉴定了五种免疫细胞类型，即 T 细胞、髓样细胞、浆细胞、B 细胞和浆细胞样树突状细胞 （pDC），以及三种非免疫细胞类型（上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞）（图5b).分别分析髓系细胞，并进一步分为四个亚簇（巨噬细胞、单核细胞、循环细胞和树突状细胞）。值得注意的是，C5aR1 的表达特异性局限于髓样细胞，尤其是在巨噬细胞和单核细胞中 （图5c），这与免疫荧光观察到的C5aR1和CD68的共表达一致（补充图S4A-B）。C5aR1在肿瘤细胞中几乎不表达或很少表达，肿瘤细胞属于上皮细胞簇。通过创建直方图来可视化C5aR1在不同细胞类型上的表达分布，计算平均荧光强度（MFI）并统计分析数据，确认了巨噬细胞，中性粒细胞和单核细胞的主要表达，而不是T细胞和肿瘤细胞（补充图S4C）。差异表达基因分析表明，Il10、CD163和Ccl20在C5aR1巨噬细胞中上调（+图5d).DEGs的基因本体（GO）术语富集分析显示，除了负调控淋巴细胞增殖、免疫应答和细胞因子产生以重塑免疫微环境外，C5aR1巨噬细胞还具有正调控VEGF产生和血管生成的潜力（+图5e).基因集富集分析（GSEA）一致表明，C5aR1巨噬细胞中上调的基因在IL-10通路、TGF-β信号转导、M2极化和吞噬作用中富集，表明存在免疫抑制表型（+图5f).此外，预测C5aR1巨噬细胞通过MIF−（CD74+CXCR4）和MIF−（CD74+CD44）轴与细胞毒性CD8+ T细胞和幼稚CD8T细胞相互作用，表明C5aR1巨噬细胞可以调节CD8 T细胞的增殖和效应功能。推断 C5aR1 巨噬细胞通过 NECTIN2-TIGIT 轴与 Treg 细胞相互作用，据报道，这促进了 HGSC 中 Treg 细胞的免疫抑制功能。这些数据表明，肿瘤相关巨噬细胞 （TAM） 是 C5aR1 的主要细胞来源，并有助于 HGSC 的免疫抑制微环境。


6.C5aR1 和 PD-L1 表达组合与致癌通路活性、治疗特征和分子改变相关
由于 C5aR1 和 PD-L1 表达都是 HGSC 中OS的独立预后因素（图1c），假设 C5aR1 和 PD-L1 的组合可以提高 HGSC 中 OS 的可预测性和对靶向治疗的反应。观察到 C5aR1 和 PD-L1 表达在 mRNA 水平上呈正相关（图6a).此外，根据PD-L1表达状态对C5aR1的危险曲线分析显示，在PD-L1表达水平高于中位数（图6b).生存分析证实了 C5aR1 的延长生存结局低PD-L1型高亚组 （图6c).为了在表达水平上表征致癌通路的活性，通过计算每个肿瘤（图6d).C5aR1的致癌通路增加，包括 RTK-RAS、细胞周期、WNT、Hippo、PI3K、p53、JAK-STAT 和 TGF-β 信号通路高PD-L1型高亚组，而 Notch信号转导在 C5aR1 中增加高PD-L1型低子群 (图6d).接下来，剖析了由最常用于推断治疗的基因组成的治疗特征（图6e).The C5aR1低PD-L1型低亚组富集了 ATRBRCA 通路信号转导，而 C5aR1高PD-L1型低亚组富集了 EGF、EGFR、VEGF 和 VEGFR 信号转导。IFN-γ的高特征评分表明短期IFN-γ刺激可以进一步上调抗原呈递活性，这可以解释C5aR1预后良好的可能机制低PD-L1型高亚组 （图6e).为了阐明分子景观，C5aR1高表达 PD-L1型高亚组显示与迁移和侵袭相关的间充质表型（图6f)。相比之下，C5aR1低表达PD-L1型高亚组表现出免疫反应性表型，临床结局较好。The C5aR1低PD-L1型高亚组在先前确定为铂敏感的患者中富集。C5aR1高PD-L1型低亚组的RICTOR DNA改变率高于其他亚型，这将赋予mTORC2通路异常活性。最后，评估了转录组学特征和基因组改变的临床相关性，并描述了HGSC患者治疗选择的基本原理（图6g).C5aR1的肿瘤低PD-L1型低亚型可能受益于免疫疗法或 PARP 抑制剂，而 C5aR1低PD-L1型高亚型可能对免疫疗法或化疗敏感。亚型 C5aR1高PD-L1型低可能对抗血管生成靶向治疗敏感。The C5aR1高PD-L1型高亚型可能受益于 RAS 通路抑制剂或 TGF-β抑制剂。总体而言，基于 C5aR1 和 PD-L1 panel 的 HGSC 分类值得进一步评估，以实现精准靶向治疗。

 




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中科生信是一家专业从事生物技术服务的公司，提供生物医学领域的定制化数据分析服务。公司业务有：二代测序平台、数据库搭建技术、测序个性化分析平台、以及生信分析定制化服务！致力于为客户提供“一站式”科研服务。
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