骨肉瘤- 大数跨境

中科生信

2023-10-31

导读：大家好！今天小编和大家分享一篇23年9月发表在Bioengineering (Basel)（IF：4.6）杂志的文章

大家好！今天小编和大家分享一篇23年9月发表在Bioengineering (Basel)（IF：4.6）杂志的文章《A Disulfidptosis-Related Gene Signature Associated with Prognosis and Immune Cell Infiltration in Osteosarcoma》。骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是一种主要影响全球儿童和青少年的侵袭性骨恶性肿瘤。最近发现的一种细胞程序性死亡（称为双硫死亡）可能会对癌症的进展产生影响。然而，它在OS中的作用仍不清楚。因此，对OS中的双硫死亡相关基因（DRGs）进行了全面研究。该研究揭示了特定DRGs（尤其是MYH9和LRPPRC）的表达与OS结局之间的明显关联。在此基础上，建立风险模型和列线图精确预测OS的预后。发现，DRGs与免疫细胞浸润水平、各种免疫检查点、免疫治疗相关的基因密切相关。总之，本研究说明了DRGs（尤其是MYH9和LRPPRC）可作为诊断OS患者的可靠预后标志物。

背景

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是一种可怕的恶性肿瘤，主要影响处于快速生长期的青少年。其发病部位通常是长骨的骨骺，而且往往预示着预后不良。如果不进行干预，OS会导致严重残疾。复发和转移（尤其是肺部）并不少见，这进一步加重了预后。然而，辅助化疗和新辅助化疗的创新为这些患者带来了更好的预后结果。然而，复发性疾病或肺转移患者的生存率仍然很低。早期的研究表明，局限性OS患者的五年生存率超过70%，而肺转移或复发性的OS患者的五年生存率降至25%。因此，深入研究该疾病的发病基础并揭示新的预后标志物对于改善OS患者的预后至关重要。

双硫死亡是一种迄今为止未知的细胞程序性死亡形式。当细胞缺少葡萄糖并过量表达SLC7A11时，细胞内二硫化物的积累会触发这种细胞死亡。与铁凋亡和细胞凋亡等其他细胞死亡途径不同，双硫死亡取决于肌动蛋白细胞骨架对二硫化物应力的敏感性。研究认为，通过抑制葡萄糖转运体诱导双硫死亡可抑制肿瘤增殖，从而凸显其在肿瘤学中的潜在用途。这种机制通过阻断肿瘤细胞对葡萄糖的摄取，减少NADPH的产生，破坏肌动蛋白-骨骼蛋白的平衡，最终导致双硫死亡。双硫死亡与多种肿瘤的预后有关，包括肺腺癌、肝细胞癌、肾细胞癌和结肠腺癌。此外，免疫微环境可使癌细胞避开免疫监视，被认为是影响骨肉瘤治疗反应的核心因素。因此，旨在改变免疫微环境和利用原有免疫力消灭骨肉瘤细胞的疗法因其巨大的临床前景而备受关注。研究表明，双硫死亡可能会影响免疫细胞的浸润，从而可能影响癌症的演变、免疫逃避和治疗效果，尤其是在肺腺癌等疾病中。也有报道称，SLC7A11与癌症中的各种免疫细胞之间存在有趣的相关性，暗示了SLC7A11在肺腺癌中调节T细胞功能的作用。尽管双硫死亡最近才出现，但它在肿瘤学和免疫微环境中的许多方面仍有待探索。

综上所述，本研究目标有两个：（1）开发基于双硫死亡相关基因（DRGs）的风险模型，用于预测OS结果。（2）通过比较高危组和低危组，评估药物反应并识别肿瘤环境中的免疫特征。结果表明，了解DRGs可以显著提高OS预后评估的准确性，为骨肉瘤的定制治疗策略提供见解。

方法

从TARGET（https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/target）数据库下载OS患者的临床信息和转录组数据，从GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下载了GSE21257数据集；从前人文献中获得双硫死亡相关基因（DRG）；
利用“ConsensusClusterPlus”包将OS划分为不同的亚型；
鉴定OS中与双硫死亡相关的预后特征基因，构建预后模型；
预后模型的独立预后分析；
列线图的构建和评估；
功能富集分析；
肿瘤微环境以及药物敏感性分析。

结果

1、骨肉瘤中DRGs亚型的鉴定

通过对12个DRGs进行共识聚类分析，发现了两个基因簇亚型：基因簇1（18个样本）和基因簇2（68个样本）（图1A-B）。结果表明，基因簇2在总生存期和无事件生存期（EFS）方面预后较好（图1C-D），但差异缺乏统计学意义。PCA图显示了这些亚型之间的不同模式（图1E）。此外，群组间免疫细胞浸润的差异也很明显（图1F）。在簇1中，记忆B细胞、CD8阳性T细胞、调节性T细胞和单核细胞明显聚集，而浆细胞、静息CD4阳性T细胞、M0型巨噬细胞和M2型巨噬细胞与簇2相比则明显受到抑制。

2、双硫死亡相关预后模型的构建

单变量Cox回归分析从TARGET数据库（训练集）的86个OS样本中确定了两个相关的DRG：MYH9和LRPPRC（图2A）。LASSO回归从12个变量中确定了3个重要基因，包括MYH9、TLN1和LRPPRC，证实了这些DRGs与OS预后的相关性（图2B-C）。利用"survminer "软件包计算了风险评分，并将患者分别分为高风险（HR，n = 22）和低风险（LR，n = 64）组。在PCA图（图2D）中，各风险组的样本特征明显不同。

在风险评分、生存状况和预后DRGs热图（图3A-C）中，LR和HR存在明显不同。KM生存分析表明，HR组的预后较差，包括总生存期（p = 0.00021）和EFS（p = 0.0063）（图3D-E）。随时间变化的ROC曲线证实了该模型的稳健性，预测1、3和5年总生存期的曲线下面积（AUC）值分别为0.762、0.679和0.700，预测EFS的曲线下面积（AUC）值分别为0.773、0.619和0.659（图3F-G）。

类似的研究结果在验证集中也得到了重复，在不同风险组之间观察到了不同的模式（图4A-C）。KM生存率分析强调了不同风险组之间总生存率（p = 0.04）（图4C）和MFS（p = 0.029）（图4D）的显著差异。1年、3年和5年总生存率的AUC值分别为0.714、0.573和0.545，无转移生存率的AUC值分别为0.625、0.648和0.647（图4F-G）。

3、预后模型的独立性验证

在评估DRG特征在临床环境中的预后意义时，采用了单因素Cox回归模型，目的是确定风险评分以及性别、年龄、肿瘤转移、局部复发模式和原发肿瘤位置等变量是否可以作为OS患者的独立预测因子。单因素Cox回归分析结果显示，OS患者的风险评分（Hazard Ratio=2.070，p = 0.003）、无转移（Hazard Ratio=0.178，p < 0.001）和诊断时转移状态（Hazard Ratio=5.070，p < 0.001）与OS患者的总生存期显著相关（图5A）。虽然诊断时的年龄、性别和转移状态在风险组之间分布相当，但与非转移患者相比，转移患者的风险评分更高（p < 0.05）（图5B）。此外，Kaplan-Meier曲线表明，每个亚组的HR患者都表现出不良预后，尽管并非所有病例都观察到统计学意义（图5C）。这些结果表明，所建立的风险模型在预测OS预后方面具有显著的独立性。

4、列线图的构建和验证

为了加强对OS患者1年、3年和5年生存期的预测，构建了一个将风险评分与临床属性（包括性别、年龄、转移状态、诊断时的转移状态、局部复发状态和原发肿瘤部位）相结合的列线图（图 6A）。这个列线图根据患者的具体属性为每个变量打分，最终得出一个总分，预测特定时间点（1 年、3 年和 5 年）的生存率，从而帮助预测生存率。使用ROC曲线和校准曲线评估了提名图的性能（图6B-D）。1、3和5年总生存率预测的AUC值分别为0.934、0.787和0.818。如实线和虚线所示，校准曲线显示实际生存概率和优化生存概率非常接近，表明预测结果准确性高。

5、基因功能富集分析

为了进一步探索潜在的生物学过程和信号通路，我们在TARGET训练集的高低风险组之间共鉴定了102个DEGs，包括62个上调基因和40个下调基因。从OS患者的DEG分析中得出了不同的风险组模式，如热图（图7A）所示。利用基因组变异分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA）进行的进一步分析表明，HR样本富集了癌症标志基因，包括DNA修复、上皮-间质转化和血管生成等。KEGG通路分析的结果显示，与风险相关的DEGs显著富集于免疫相关通路，如局灶粘附、细胞因子-细胞因子受体相互作用和T细胞受体信号通路。此外，细胞结构相关过程，如肌动蛋白细胞骨架的调节，也被发现富集（图7B）。图7B显示了调整后p值小于0.01的18个重要标志通路和调整后p值小于0.001的19个重要KEGG通路。为了证实这些发现，我们进行了基因组富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA），进一步验证了细胞结构和免疫相关的生物过程和通路在风险相关的DEGs中的富集程度（图 7C-E）。图7C中分别显示了生物过程、分子功能和细胞内容的前五个通路。图中显示DEGs参与了细胞外基质组织、细胞外基质结构组织等生物过程，以及趋化因子受体结合、细胞因子结合、整合素结合等分子功能。在图7D-E中，强调了这些DEGs与KEGG通路的明显关联。这些通路包括B细胞受体信号转导、趋化因子信号转导、白细胞跨内皮迁移、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、T细胞受体信号转导等。这些结果证明，这些DEGs与骨肉瘤样本中的免疫微环境有着内在联系。这种联系可能有助于了解预测骨肉瘤患者预后的潜在机制。

6、高低风险组中肿瘤微环境分析

为了阐明DRG与免疫特征之间的关联，采用了CIBERSORT算法来计算各种免疫细胞群的富集分数。图8A-B描述了免疫细胞浸润的情况，强调了CD8 T细胞、调节性T细胞、巨噬细胞M0、巨噬细胞M2和浆细胞在OS微环境中的显著存在。随后，CIBERSORT算法强调了不同风险组间免疫细胞浸润的差异。结果显示，HR和LR之间记忆B细胞、静息NK细胞、活化NK细胞和巨噬细胞M2的数量存在显著差异（图8C）。值得注意的是，图8C显示HR骨肉瘤样本中活化的NK细胞丰度较高，而记忆B细胞、静息NK细胞和巨噬细胞M2被下调。此外，我们还观察到，与LR患者相比，HR患者的免疫评分（p < 0.001）、基质评分（p < 0.001）、ESTIMATE 评分（p < 0.001）计算值较低，而肿瘤纯度指数（p < 0.001）较高(图8E）。

7、免疫检查点和药敏分析

为了评估免疫检查点抑制剂（ICIs）对OS的作用，研究人员考察了风险组与ICI常见靶点之间的关联，揭示了检查点相关基因表达的差异。结果显示，不同风险组间免疫检查点相关基因的表达存在显著差异，包括CD40LG、IDO2、LAIR1、TNFSF15、CD160、LAG3和TIGIT（图9A）。上述所有ICIs在HR样本中均出现下调，包括化疗和靶向治疗在内的系统治疗在OS中的应用前景越来越广。因此，对不同风险评分组对特定药物的敏感性进行了研究，旨在根据已确定的风险组别确定潜在的治疗方案。来自GDSC2的数据（包括药理学信息）显示，74种药物的作用（p < 0.05）与风险组别相关，特别是索拉非尼、他莫昔芬、端粒酶抑制剂IX、乌利替尼、TAF1_5496等代表性药物的IC50值（图9B），显示HR样本的IC50值较低，p < 0.001，具有统计学意义。

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