早！今天小编和大家分析一篇2023年6月发表在《Front Immunol》（IF:5.0）期刊上的文章《Mitochondrial DNA methylation is a predictor of immunotherapy response and prognosis in breast cancer: scRNA-seq and bulk-seq data insights》。本研究采用生物信息学工具，确定了BC中线粒体DNA甲基化（mitochondrial DNA methylation, MTDM）相关基因（MTDM-associated genes, MTDMAGs），并建立MTDMAGs预后模型；进一步使用免疫微环境、微卫星不稳定性、突变、无监督聚类、恶性细胞亚型分化、免疫细胞亚型分裂和细胞通讯特征分析来评估MTDM介导的免疫微环境的改变。最后，通过细胞实验来验证MTDM相关预后基因NCAPD3在BC中的作用。这些富有洞察力的发现为肿瘤免疫提供了新的视角，并有可能彻底改变BC的诊断和治疗。该思路同样适用于其它肿瘤分析，有相关需求的老师欢迎联系我们。
背景：
线粒体DNA甲基化（mitochondrial DNA methylation, MTDM）的改变存在于许多肿瘤中，但其在乳腺癌（breast cancer, BC）发展中的作用尚不清楚。
方法：
1，结合scRNA-seq和bulk-seq来分析BC患者的数据；
2，TCGA数据的加权共表达网络分析（WGCNA）确定了BC中MTDM相关基因；
3，COX回归和LASSO回归用于建立预后模型；
4，使用多种方法评估MTDM的生物学功能，如信号通路富集分析、拷贝数核型分析和细胞增殖率的定量分析；
5，使用免疫微环境、微卫星不稳定性、突变、无监督聚类、恶性细胞亚型分化、免疫细胞亚型分裂和细胞通讯特征分析来评估MTDM介导的免疫微环境的改变；
6，进行细胞实验来验证MTDM相关预后基因NCAPD3在BC中的作用。
研究结果：
（一）单细胞测序分析描述MTDM分区和BC细胞定位
利用GSE195861数据集进行单细胞数据分析。使用“KNN”算法，将选定的细胞分为12个簇（Fig 1A），然后根据细胞特异性标记物的表达水平对其进行注释。注释结果显示，簇中存在五种细胞类型：B细胞、T细胞、内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞和其他细胞类型，其中上皮细胞最多，内皮细胞最少（Fig 1B，Fig 1C）。为了确定筛选细胞中的MTDM水平，根据MTDM相关基因表达的中位数，将注释细胞分为高MTDM组和低MTDM组，高MTDM组主要集中在上皮细胞和巨噬细胞中（Fig 1D）。通过检测MTDM相关基因的表达来验证MTDM组划分的准确性。结果显示，在低MTDM组中，所有线粒体编码的多肽都显著上调（Fig 1E），与之前的报道一致。因此，MTDM组的划分是合理的。为了确定MTDM和BC恶性肿瘤之间的相关性，我们将注释细胞分化为导管原位癌（DCIS）和浸润性导管癌（IDC）细胞（Fig 1F）。结果显示，与DCIS组相比，更具侵袭性的IDC组的上皮细胞与高MTDM组的上皮细胞有更高的重叠。因此，高MTDM状态可能有助于BC的进展。
（二）线粒体DNA甲基化程度高的BC细胞容易恶性
为了进一步探索具有高MTDM状况的BC细胞的恶性倾向，进行了生物途径富集分析和拷贝数核型分析。生物途径富集分析结果表明，MTDM组基因的改变不仅发生在增殖相关的E2F信号通路、MYC信号通路、G2M检查点、转移相关的WNT信号通路和上皮-间充质转化相关的生物通路中，还发生在细胞凋亡、血管生成、炎症反应和代谢相关的通路中（Fig 2A）。拷贝数核型分析表明，恶性BC细胞主要集中在上皮细胞中，其分布区域与高MTDM区域高度重叠（Fig 2B）。考虑到肿瘤增殖率较高的患者通常预后较差，通过使用增殖相关标志物区分单个细胞，进一步检查了MTDM状态和增殖之间的关系（Fig 2C）。结果显示，高增殖区与高MTDM区重叠，表明高MTDM状态下有恶性倾向。为了探索影响MTDM的关键基因，使用WGCNA分析了与MTDM相关的基因模块获得了7个非灰色模块，其中绿松石和黄色模块与MDTM评分的相关性分别为0.68和-0.53，这两个模块中包含的基因与MDTM得分密切相关（Fig 2D）。选择P值＜0.001的基因进行进一步分析。
（三）线粒体DNA甲基化状态对BC预后有价值
考虑到MTDM水平变化对各种生物学过程的影响，作者研究了与MTDM水平改变相关的基因是否可以作为BC患者的预后指标。因此，基于564个高和低MTDM组的差异表达基因和WGCNA分析所得的MTDM相关基因，进行单变量Cox分析，在TCGA队列中确定了16个与患者预后相关的基因（P＜0.05）。进一步进行LASSO回归分析，并鉴定了11个基因（ARID1B、B3GNT2、MPHOSPH10、NCAPD3、RABGAP1、RBM41、RBMXL1、SLBP、TMEM167A、TMEM67和TUBGCP5）（Fig 3A，Fig 3B）。为了将患者分为高风险组和低风险组（即高MTDM组和低MTDM组），使用11个基因和中位数构建了预后模型。结果显示，TCGA训练队列中的高MTDM组的预后比低MTDM组差（P<0.0001，Fig 3C）。在GSE21653验证队列中也观察到了同样的趋势（P=0.016，Fig 3D）。在训练和验证队列中进行ROC曲线分析，进一步评估MTDM在预测BC患者预后方面的准确性。在TCGA队列中，1年、2年和5年时的曲线下面积（AUC）值分别为0.734、0.731和0.706（Fig 3E），在验证队列中，分别为0.732、0.686和0.673（Fig 3F）。这些结果表明，在两个队列中，MTDM状态可以准确地用于预测BC患者的预后。此外，作者对训练集和验证集模型中的11个基因进行了主成分分析，结果表明，构建的模型可以区分两个队列中的高MTDM和低MTDM（Fig 3G，Fig 3H）。
（四）筛选正向调节乳腺癌细胞增殖的MTDM相关预后基因
由于MTDM水平的改变可能影响BC细胞增殖，因此需要进一步筛选积极调节BC增殖的MTDM相关预后基因，这些基因可能被用作治疗靶点。因此，作者首次探索了MTDM相关预后基因在不同细胞类型中的表达。结果显示，除ARID1B在B细胞中高表达外，所有MTDM相关基因在上皮细胞中均高表达（Fig 4A）。此外，所有与MTDM相关的预后基因在恶性细胞和具有高MTDM状态的细胞中高度表达（Fig 4B-4D）。
此外，作者研究了高增殖率组和低增殖率组中MTDM预后相关基因的表达（Fig 5A），发现除ARID1B在低增殖率小组中高表达外，所有MTDM相关预后基因在高增殖率小组均高表达。同样，在TCGA BC患者队列中使用ssGSEA生成增殖相关标志物的评分（Fig 5B）。高增殖率组和低增殖率组通过增殖相关标志物得分中位数进行区分（Fig 5C）。结果表明，MPHOSH10、NCAPD3和SLBP在高增殖率下高表达，其中在NCAPD3中观察到最显著的差异。相关热图结果还显示，NCAPD3与增殖相关标志物呈显著正相关，并与MKI67的相关性为0.52（Fig 5D）。进一步细分了恶性细胞，以关注MTDM相关预后基因与恶性细胞之间的关系。共鉴定了六个恶性细胞簇（Fig 5E），并比较了每个簇的特征基因，发现簇1在增殖相关标记物中高度表达，如MKI67、CCNB1和UBE2C（Fig 5F），GSVA分析还显示簇1在增生相关通路中高度富集，如MYC信号通路、DNA修复通路，E2F信号通路和G2M检查点信号传导（Fig 5G）。这表明簇1是处于增殖状态的恶性细胞。最后，研究了恶性细胞亚群中MTDM相关预后基因的表达，与TCGA BC患者队列一致，NCAPD3在增殖状态的恶性细胞中表达最高（Fig 5H）。这些结果还表明，高MTDM状态可能促进恶性细胞增殖，尤其是NCAPD3可能在这一过程中发挥关键作用。
（五）免疫微环境的变化表明MTDM状态可能响应BC免疫治疗的敏感性
接着，作者探讨了高MTDM组和低MTDM组之间免疫细胞浸润水平的差异。结果显示，低MTDM组的免疫细胞浸润增加，包括B细胞、NK细胞和T细胞（Fig 6A）。分析了免疫检查点相关基因的表达，结果显示，纳入研究的免疫检查点有关基因在低MTDM组中高度表达（Fig 6B）。为了探讨免疫疗法是否更适用于低MTDM组，计算了MSI和TMB评分，以评估它们与MTDM的关系。结果表明，高MSI组的MTDM评分较低（Fig 6C），这一证据表明，低MTDM组的患者可能从免疫检查点抑制剂中受益更多。然而，作者发现高MTDM组的TMB较高，并且与免疫浸润程度呈负相关，这与大多数研究中TMB与免疫浸润之间的正相关不一致。因此，TMB评分不适合作为BC免疫治疗的生物标志物。为了进一步验证这个预测，作者使用了免疫疗法治疗的黑色素瘤患者队列GSE91061（Fig 6D）。正如预期的那样，低MTDM组获得CR或PR的患者比例最大。同时，无监督聚类显示，在TCGA数据集中，MTDM相关预后基因分为两组（Fig 6E-6F）。两组之间的免疫细胞也存在显著差异（Fig 6G），聚类B显示MTDM相关预后基因的表达较低，免疫细胞浸润水平较高。最后，在单细胞数据集中分化了T细胞，根据决策树，最佳聚类阈值为12个（Fig 6H）。根据可用的标记物，将T细胞分为CD8阳性T细胞、耗竭性CD8 T细胞、T卵泡辅助细胞、效应记忆T细胞、幼稚T细胞和Tregs（Fig 6I）。两组之间的细胞比例显示，高MTDM组具有更高比例的耗竭性CD8 T细胞（免疫功能障碍的标志物），而低MTDM组的CD8阳性T细胞比例更高（Fig 6J-6K）。这些结果表明，低MTDM组可能对免疫疗法更有反应。
（六）细胞通讯揭示了MTDM介导免疫抑制的潜在途径
接着，作者探索了不同MTDM状态下恶性细胞与T细胞亚群之间的细胞通讯特征，细胞间通讯特征可以有效识别细胞群之间存在的受体-配体关系，使用这种方法来揭示高MTDM/增殖相关的恶性细胞和免疫细胞亚群之间可能的配体-受体对，作为对这两个亚群之间的联系和潜在作用机制的反应。结果表明，高MTDM恶性细胞发出GDF15信号（Fig 7A）。相反，衰竭的CD8 T细胞依赖GDF15的受体TGFBR2来接收该信号（Fig 7B-7C）。此外，高MTDM恶性细胞分泌GDF15和耗竭的CD8 T细胞表达TGFBR2是细胞特异性的（Fig 7D）。这些研究结果表明，具有高MTDM状态的恶性细胞可能通过分泌GDF15导致CD8 T细胞耗竭，从而导致免疫抑制。同样，作者探索了增殖相关恶性细胞（簇1）和T细胞之间的细胞间通讯。Fig 7E显示了衰竭的CD8 T细胞和高MTDM恶性细胞之间的整体通讯。同样的结果表明，增殖相关的恶性细胞特异性分泌GDF15，耗竭的CD8 T细胞接收该信号（Fig 7F-7H）。这表明GDF15可能是具有高MTDM状态和增殖率的恶性细胞的免疫抑制反应的关键因素。
（七）体外实验证实，MTDM相关预后基因NCAPD3确实促进乳腺癌细胞的增殖
由于NCAPD3在增殖相关恶性细胞中表达水平最高，并且与增殖相关基因呈正相关，于是作者进一步探讨了NCAPD3对BC的表达及其对免疫微环境的影响。在TCGA转录组中，NCAPD3在肿瘤中也高度表达（Fig 8A）。然后，分别评估了NCAPD3表达与免疫评分和MSI之间的相关性，发现NCAPD3的表达与免疫得分和MSI呈负相关（Fig 8B-8D）。接下来，在体外对NCAPD3敲除进行生物功能验证，以测试模型基因敲除是否阻止乳腺癌症细胞系的生长，这可能间接反映NCAPD4敲除是否改善乳腺癌症患者的预后。首先，使用q-PCR验证了转染后1天MDA-MB-231-BC细胞系中NCAPD3的mRNA水平（Fig 8E），并发现所有siRNA干扰均导致NCAPD3 mRNA表达显著降低（P<0.05）。作者还通过蛋白质印迹验证了转染2天后MDA-MB-231和BCAP-37BC细胞系中NCAPD3的蛋白水平（Fig 8F-8G），并再次发现siRNA序列导致NCAPD3蛋白水平降低（P<0.01）。为了评估NCAPD3对细胞增殖的影响，作者进行了CCK8和克隆形成测定。CCK8结果显示，在NCAPD3敲除后，与siRNA阴性对照（NC）组相比，MDA-MB-231和BCAP-37BC细胞系的细胞活力显著降低（P<0.05）（Fig 8H-8I）。克隆测定的结果显示，在两种BC细胞系中，NCAPD3表达减少的集落数量显著减少（Fig 8J-8K）。最后，进行了划痕分析，以测试NCAPD3敲低是否影响BCAP-37BC细胞系的迁移能力。结果显示，NCAPD3敲除组的划痕愈合明显慢于siRNA阴性对照组（NC）（Fig 8L），表明NCAPD3的敲除可能是抑制BC细胞增殖和迁移的有效策略。这些结果表明，NCAPD3靶向可能是BC治疗的理想结果，并可能改善患者预后。
