8+ 单细胞胃癌分析思路

单细胞RNA测序（scRNA-seq）已被用来描述胃癌（GC）细胞群和TME的异质性。TME的间和内异质性提供了与巨噬细胞和细胞毒性T细胞的转录多样性。另外，GC的基因组内异质性提供了GC患者中GC细胞系的多样性，因为它不仅在GC队列中具有高度的预后性，而且在几个大规模的GC队列中表现较好。然而，所有这些用于分析肿瘤可塑性的高通量方法都有一个局限性。

因此，本研究旨在通过单细胞转录组分析来描述GC的细胞异质性。为此，我们对邻近的癌前病变和GC病变的癌细胞图谱进行了分析。我们还通过分析根据劳伦分类的细胞群，评估了肿瘤的可塑性。最后，我们通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和批量测序对被掩盖的肿瘤细胞特征进行分类，以确定胃癌发生中细胞从癌前状态向恶性状态转变的分子标记。

胃癌细胞群

从24名胃癌（GC）患者中，获得了配对的非癌组织和癌组织（方法）。在24个相邻的非癌部位中，16个被归类为恶性肿瘤前期病变（CAG或IM），8个显示良性浅表性胃炎。GC患者显示出Epstein-Barr病毒（EBV，4.2%）或幽门螺旋杆菌感染的迹象（79.2%），但没有观察到微卫星不稳定性（MSI）。

为了阐明GC细胞的异质性，我们选择了13022个被注释为基质（成纤维细胞、内皮细胞和内分泌细胞）、上皮细胞和肿瘤细胞的细胞）。其中，7095个细胞（54.5%）来自匹配的相邻非癌症病灶，5927个细胞（45.5%）来自GC病灶。聚类分析确定了10个不同的子聚类。这些细胞类型被描述为内皮细胞（EC；表达PLVAP、KDR、PTPRB）、肠内分泌细胞（表达CHGA、GAST、PROX1）、成纤维细胞（表达MMP2、PDGFRA、MYL9、FN1、CAV1）、腺粘膜细胞（GMC。表达MUC6和TFF2），IM（肠化生；表达TFF3、CDX1、CDX2）[首席（表达PGC），小肠（表达MUC2、ITLN1、HES6），化生性干细胞（MSC。表达OLFM4、REG1A、CLDN3）和增殖细胞（PC；表达CDKN2A、MKI67、RBP4）]、凹陷粘液细胞（PMC；表达GKN1、GKN2、MUC5AC）和肿瘤细胞（表达EPCAM、CDH17、COL3A1、PDGFRB），根据每个簇的DEG与各种细胞类型的已知标记基因进行比较（图1b-e，）。来自每个簇的细胞在不同的患者中是无偏的分布。我们对每个簇的患者数量进行了比例测试，发现每个细胞簇的样本频率没有明显的高或低。我们估计了CNVs来区分肿瘤细胞群，发现与其他细胞类型相比，肿瘤细胞群的CNV信号较高。我们根据CDX1和CDX2的表达定义了IM集群（图1b，c），然后进一步将其聚类为子IM细胞类型。在4115个细胞中，确定了6个集群，并将其分为5种细胞类型（图1d，e）。

图1

劳伦分类相关的GC细胞谱系

我们接下来建立了一个拟时序轨迹来追踪细胞谱系。如上述描述，GC和邻近的非癌症病变都是从IGC和DGC患者身上收集的。为了研究GC中两种劳伦类型的异质性，我们汇集了24个样本的所有选定的细胞（非免疫细胞），也分析了每个IGC和DGC的系/状态组成。使用Monocle1从13,022个数据集中重建了GC细胞的轨迹（图2a）。拟时序从良性细胞到恶性细胞类型增加。非恶性细胞，如肠内分泌细胞和GMCs，在细胞系中显示较早的假时间，而肿瘤细胞显示较晚的拟时序的轨迹（图2a）。已知的IGC标记物MUC13和CDH1718以及已知的DGC标记物COL1A2和SPARC19在树上的表达水平从GMCs到肿瘤细胞都有所增加。已知的IGC标志物，在I3状态下表达水平很高（图2c，e）。成纤维细胞、ECs和一些肿瘤细胞位于I4状态。我们追踪了从IM（间充质干细胞和吞咽细胞）到肠道肿瘤细胞的细胞系变化的肿瘤性进展（图2b）。许多IGC标记基因的表达水平从I1到I3状态持续增加。IGC细胞在轨迹树中的可视化显示，中间时间点的IM细胞在后期比GMC更接近肿瘤细胞。基于这些观察，我们提出IGC细胞系显示出从IM到肿瘤的肿瘤性进展模式，而IM可能是符合Correa假说的前体状态。我们用来自DGC患者的8946个细胞（4336个来自GC病变，4610个来自邻近的非癌症病变）建立了DGC的轨迹。细胞沿四个分支排列（图2b；右图），根据假性时间分为四个进展状态（D1、D2、D3和D4）。GMCs显示较早的假时（D1），成纤维细胞和ECs位于D5。肿瘤细胞在轨迹树（D3和D4）上显示较晚的假时。DGC标志物，如COL1A2，在D4表达（图2c，e），细胞外基质相关通路基因明显富集（P=1.11e-16）。IGC标记基因，包括CEACAM5、KRT8和MUC1318，在D3中高度表达（图2c）。几个与IM有关的通路，包括WNT信号、启动粘膜愈合的Trefoil因子和HEDGEHOG配体，在癌前状态I2和D2中富集（P<9.03e-03；图2d）；在IGC中发挥作用的mTOR信号、RAS通路和VEGF信号，在I3和D3状态中高度富集（P<0.01；图2d）。为了确定D1-D3细胞是否遵循肠道细胞谱系，我们确定了每个级联中的DEGs。无论何种病理分类，参与癌症进展的基因都有重叠，不包括D4状态（图2c）。

图2

DGC中的肿瘤细胞亚群和上皮细胞-肌成纤维细胞过渡

为了了解肿瘤细胞的特征，并扩展先前的GC分子亚型，我们对所有确定的肿瘤细胞进行了重新聚类，显示了八个亚细胞群（图3a）。IGC标志物（CDH17、REG4和MUC13）在C1和C2高度表达，DGC标志物（COL1A1和S100A4）分别在C0和C3-C7高度表达（图3b）。几乎所有的肿瘤细胞都被归入先前的GC分子亚型，称为ACRG亚型，使用ACRG标志物（MSS/TP53+，MSS/TP53-，MSI和EMT；补充方法），如预期（图3a，右面板）。C1和C2中的细胞，显示出IGC标记基因的高表达，其MSS/TP53+和MSS/TP53-的特征得分很高，这是IGC6的主要分子表型。C0、C3、C4、C6和C7中的细胞，显示出DGC标记基因的高表达，具有明显的EMT特征，是DGC23的主要分子表型。此外，还发现了30个MSI细胞，它们分散并富集在C1和C2（P = 4.18e-09；Fisher精确检验）。我们推断，MSI细胞类型在我们的样本中观察到的频率很低，这与病理检验是一致的。这些结果表明，四个主要的分子亚型在单细胞水平上是可以重复的。

图3 1003个肿瘤细胞的t-随机邻接嵌入（t-SNE）图。左图是八个肿瘤细胞子群的t-SNE图。b t-SNE图显示标记基因的表达模式。c 八个子群的功能特征。癌症相关签名的平均表达，包括八个亚群内的EMT、EmyoT和干性；签名模式显示了三种分子亚型（肠道：蓝色，EMT：绿色，EmyoT：红色）。d 基于批量RNA元数据的三种分子亚型的五年生存率（n = 1378）。危险比和P值通过Cox回归计算；肠道组作为参考组。e 血红素和曙红（H&E）以及SRF、IGFBP5和MRTFA的免疫组化染色。每个标记物的染色结果构建的数字图像；数字图像中的重叠位置在底部表示。

IGC细胞系中的CCND1变异情况

我们确定了35个致癌基因的574个变体作为GC细胞的热点突变（图4a），这些变体在细胞周期、MAPK信号传导和其他信号传导途径中富集。细胞周期相关基因，包括CCND1、CDK4、CDKN2A和RB1，在间充质干细胞、PC和肿瘤细胞中经常发生突变（补充图10a）。CCND1经常在两个功能增益位点发生突变（T286和P287；图4a）。这些突变推动了细胞转化、核出口和蛋白酶体介导的降解32,33,34。此外，CCND1mut激活G1/S途径和调节G1/S途径基因在GC癌变中的作用35,36,37，这些基因的表达水平在CCND1mut细胞中有所增加（图4b）。从5048个细胞（包括IM细胞）重建的前恶性和恶性细胞的轨迹显示了三个分支。恶性细胞分为两个分支，而前恶性细胞（MSCs和PC）排列在轨迹中心。CCND1mut细胞从间充质干细胞到恶性细胞被追踪到（图4c）。CCND1的CNV信号在所有细胞类型中都没有被发现。这表明CCND1mut可能是IGC的一个潜在风险因素，并可能在间充质干细胞中发挥致癌驱动作用。

图4  35个泛癌症热点基因的突变数。根据TCGA胃癌研究5，X轴上红色表示的基因藏有突变。b 癌前细胞（上）和肿瘤细胞（下）中具有CCND1热点突变的细胞的G1/S基因评分。P值通过方差分析计算。c 具有CCND1突变的细胞，特别是间充质干细胞，映射在IM和肿瘤细胞的轨迹树上。红点表示突变的细胞。

癌症相关的成纤维细胞亚型及其在GC中的作用

在GC中，癌相关成纤维细胞（CAFs）是促进或阻碍肿瘤发生的TME的关键成分之一。为了更好地了解它们在GC中的作用，我们从IGC和DGC集群中选择了有注释的成纤维细胞，并重建了一个假时空的轨迹来追踪CAF的分化。CAF的轨迹被分成三个分支，代表四个状态（图5a）。成纤维细胞标记基因如SFRP2和CXCL12在轨迹的灰色区域表达（图5a；右图），而CAF标记在两个分支末端特异性表达（图5b）。我们根据基因表达谱的状态确定了三种CAF类型：炎症型（iCAF）、肌成纤维型（myCAF）和中间型CAFs（inCAF）（图5a）。编码细胞因子（IL6、IL11和IL24）、趋化因子（CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL6）39和基质金属蛋白酶（MMP1、MMP3和MMP10）40的基因在iCAFs中独特地上调（图5b）。此外，myCAFs被已知的标记基因如TPM1、TPM2、MYL9、TAGLN和POSTN29识别（图5b）。最后，inCAFs明显分为iCAFs和myCAFs，PDGFRA、POSTN、ID1和ID3高表达（图5b）；PDGFRA是不同癌症类型中常用的iCAF标志物，ID1在myCAF中被激活。

最后，我们分析了124个正常、IM、CAG和GC样本的独立微阵列数据（GSE2669），以验证GC中存在三种不同的CAF亚型。在这些样本中，我们也能确定三种iCAF、myCAF和inCAF的生物标志物。在57名GC患者中，所有的CAF特征在GC病变中都有升高。具体来说，在癌症发展过程中（正常、CAG、IM和GC），iCAF信号在GC中很明显（图5e；P<2.2e-16）。myCAF和inCAF信号在癌症中没有明显差异（图5e），但inCAF信号随着肿瘤的发展从恶性前状态开始增加。

图5  使用注释的成纤维细胞和内皮细胞重建CAF的轨迹树。b 热图图显示了明显可变的基因（P<1.0e-05；似然比检验）和已知CAF标记物的表达。采集的细胞（列）按假时间排序，基因（行）按分层聚类排序。d 大量RNA元数据中的干性评分的箱形图（左），以及iCAFs和干性评分之间的相关性（右）。e 使用大量RNA数据（GSE2669）绘制的CAF标记基因表达模式的Boxplots，根据胃病进展级联（即。正常、恶性肿瘤前期、肠化生（IM）或慢性萎缩性胃炎（CAG）和癌症）。P值通过方差分析计算。

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