4+！预后+实验验证- 大数跨境

中科生信

2024-01-18

导读：大家好！今天小编和大家分享一篇23年发表在SCIENTIFIC REPORTS（IF:4.6）杂志的文章

大家好！今天小编和大家分享一篇23年发表在SCIENTIFIC REPORTS（IF:4.6）杂志的文章《Construction and validation of a prognostic signature based on seven endoplasmic reticulum stress-related lncRNAs for patients with head and neck squamous cell carcinoma》。作者通过TCGA数据库分析ERS相关的lncRNA为HNSCC患者开发了一种预后特征，为指导HNSCC患者的预后和治疗策略提供新的途径。

背景

头颈部鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinomas，HNSCC）是一组侵袭性、隐匿性和难以治疗的癌症，估计到2020年有84万例，预计到2030年将上升到100万例。HNSCC的治疗方式包括手术、放疗和化疗。然而，这些治疗方法往往伴随着器官功能的丧失和生活质量的降低。此外，它们在治疗晚期患者方面表现出有限的疗效。近年来，靶向免疫治疗显著提高了HNSCC患者的生存率。然而，尽管取得了这些进展，大约60%的患者对这些治疗的反应仍然很差。因此，在HNSCC发病率急剧上升的情况下，寻找有效的预后生物标志物，提高HNSCC患者的预后和治疗效果势在必行。

内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）是指在缺氧、氧化应激、钙缺失和微环境应激等应激因素的影响下，内质网管腔内未折叠或错误折叠的蛋白质过度积累的一种内稳态机制。在ERS的反应中，细胞激活一种被称为未折叠蛋白反应的适应性信号通路，通过调节特定基因的表达来应对环境变化，并将内质网恢复到正常状态。多项证据表明，ERS可能调节肿瘤细胞生物学的许多方面，如血管生成、细胞增殖、肿瘤代谢和治疗耐药性。ERS通过调节包括疾病进展和治疗耐药性在内的关键肿瘤生物学过程，在HNSCC中发挥功能性作用。综上所述，ERS可能是治疗HNSCC的一个有希望的治疗靶点。

长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一种长度超过200个核苷酸的非蛋白质编码RNA（ncRNA），可以在不同水平上参与调节蛋白质编码基因。随着对lncRNA功能的了解，越来越多的证据表明lncRNA在各种癌症中起着至关重要的作用。具体而言，lncRNA可参与癌症进展和转移，与肿瘤微环境和治疗耐药性密切相关，具有作为肿瘤预后的巨大潜力。越来越多的lncRNA参与HNSCC的发生和发展，可以预测患者的预后，成为潜在的治疗靶点。然而，ERS相关lncRNA在HNSCC中的预后潜力仍未得到充分研究。在这项研究中，基于7种ERS相关的lncRNA为HNSCC患者开发了一种预后特征。随后，研究了这些lncRNA对HNSCC预后的影响。

方法

鉴定HNSCC中ERS相关的预后lncRNA；
预后模型构建和验证；
独立预后分析和列线图评估；
功能和生物学途经分析；
肿瘤突变负荷分析；
免疫浸润分析与免疫治疗疗效评价；
药物敏感性分析；
一致性聚类分析；
PCR验证。

研究结果

1.鉴定HNSCC中ERS相关的预后lncRNA

基于TCGA数据库，获得271例HNSCC患者的RNASeq数据及相应的临床资料。通过与已发表研究中的294个ERS相关基因共表达分析，获得423个ERS相关lncRNA。通过差异分析，发现202个ERS相关的lncRNA在正常和肿瘤样本中表达有显著差异（|logFC|≥1,FDR＜0.05）。热图显示了100种ERS相关lncRNA在正常和HNSCC组织中的差异表达（图2A）。在202个ERS相关的差异表达lncRNA中，191个lncRNA在肿瘤中上调，11个lncRNA下调。结果显示在火山图中（图2B）。

为了确定与HNSCC预后相关的ERS相关lncRNA，首先整理了TCGA数据库中HNSCC肿瘤样本的生存数据，剔除了无生存信息的样本，并保留了252例肿瘤样本进行后续分析。然后将上述样本随机分为训练集和测试集，比例近似为1:1。通过单因素Cox回归分析，在训练集中筛选了46个与HNSCC患者预后显著相关的ERS相关lncRNA（图2C）。热图显示了正常组织和肿瘤组织中46种与预后相关的ERS相关lncRNA的表达（图2D）。

基于上述从训练集中筛选出的46个ERS-related lncrna，进行LASSO回归分析，进一步鉴定出14个ERS-related lncRNA（图2E、F）。接着，通过多因素Cox回归分析确定了7个与预后相关的ERS-related lncRNA，并成功用于构建预后风险模型。在模型中，根据上述7个lncRNA的系数计算风险评分。风险评分= ACTN1-AS1×(2.525895)+ AP003774.2×(−1.158778)+ DOCK8-AS1×(3.480702)+ DDX11-AS1×(−1.762455)+ MIR924HG×(−1.710509)+ MIR9-3HG×(−0.376870)+ AL451085.2×(−5.600491)。

2.预后模型构建和验证

为了更好地验证该模型的预测准确性，基于风险评分的中位值将每个队列中的HNSCC患者分为高风险组和低风险组。通过Kaplan-Meier分析评估该模型对HNSCC患者OS状态的预后效果，结果显示，在训练、检测和总队列中，低风险组HNSCC患者的生存率显著高于高风险组（p＜0.01）(图3A-C)。根据不同队列患者的风险评分和生存数据，得到患者的风险评分分布图(图3D-F)和生存状态，观察到患者的风险评分与死亡率之间存在正相关关系(图3G-I)。3胃肠道)。热图显示，在训练、测试和总队列中，高风险组和低风险组之间，7种ERS相关lncRNA的表达存在差异，不同组中各lncRNA的表达趋势是一致的（图3J-L）。

3.独立预后分析和列线图构建与评估

为了评估HNSCC患者风险评分的独立预后价值，进行单因素和多因素Cox回归分析。如图4A、B所示，与其他临床因素相比，该模型的风险评分不仅与HNSCC患者的预后相关（HR = 1.073，95% CI：1.047-1.101，p＜0.001），而且可以独立于其他临床因素有效预测HNSCC患者的生存（HR = 1.079，95% CI：1.051-1.107，p＜0.001）。采用ROC曲线分析该模型的敏感性和特异性。结果显示，该模型的ROC曲线下面积（AUC）为0.805，显著大于年龄(AUC = 0.554)、性别(AUC = 0.429)、等级(AUC = 0.487)、分期(AUC = 0.597)等其他因素（图4C）。此外，该模型预测HNSCC患者1年、3年和5年生存率的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.756、0.805和0.705(图4D)，表明该模型具有较高的准确性。所有这些发现都证明了我们的模型在预测HNSCC生存方面的稳健性。

为了便于在临床实践中对HNSCC患者的预后进行评估，开发了基于临床因素和风险评分的列线图。用列线图来估计HNSCC患者在1年、2年和3年的生存率(图4E)。校准曲线显示，HNSCC患者预测的1、2、3年生存率与实际观察到的生存率一致。此外，c -指数为0.753（95%置信区间（CI）为0.724-0.783）超过了0.7的阈值，表明该模型具有较好的预测能力(图4F)。

4.功能和生物学途径分析

为了获得高低风险组中的差异基因，使用DEseq2对训练集高低风险组进行差异分析，获得差异基因（DEGs）。对上述DEGs进行GO和KEGG富集分析，探讨其潜在功能和富集途径。这些DEGs主要富集于体液免疫应答、抗原受体介导的信号通路、B细胞活化调节、免疫球蛋白复合物和抗原结合（图6A-C）。KEGG富集分析显示，这些DEGs主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞粘附分子和JAK - STAT信号通路（图6D, E）。可见，ERS可能通过激活上述通路促进癌细胞的生长和增殖，这为探索其促癌的潜在机制提供了思路。为了探索高低风险组之间的生物学功能差异及通路，进一步进行了GSEA富集分析。结果显示，低风险组的免疫相关通路丰富，如同种异体移植排斥反应和原发性免疫缺陷。而高风险组免疫相关通路未出现显著富集(图6F、G)，这可能提示ERS与肿瘤免疫密切相关。

5.肿瘤突变负荷（Tumor mutation burden，TMB）分析

目前，越来越多的研究表明TMB有潜力作为免疫治疗的生物标志物，并指导免疫检查点抑制剂(ICIs)的临床应用。为了更好地预测患者预后和治疗效果，我们对高低风险组进行了TMB分析，并将突变状态可视化。高低风险组患者突变基因及突变率的差异通过瀑布图表示(图7A、B)。瀑布图显示，高风险组突变率明显高于低风险组(96.69% vs. 86.82%)。TP53 (71% vs. 50%)和TTN (30% vs. 54%)为主要突变基因，高低风险组的突变率不同。根据Kaplan-Meier生存曲线，我们观察到高突变组预后优于低突变组(图7C, p＜0.05)。此外，低TMB评分和高风险组的患者预后较其他组最差（图7D）。基于这些发现，可以观察到高TMB患者预后更佳，更有可能从ICIs中获益。

6.免疫细胞浸润分析及免疫治疗疗效评价

越来越多的证据表明，ERS可能会阻碍有效抗癌免疫的发展。在研究免疫细胞浸润与风险评分的相关性时，我们的研究结果显示，风险评分与大多数浸润性免疫细胞，包括T细胞CD8+、B细胞、T细胞调节（T cell regulatory, Tregs）和巨噬细胞M2等呈显著负相关。然而，我们发现一些浸润性免疫细胞与风险评分呈显著正相关，包括中性粒细胞、巨噬细胞M1、肥大细胞静息和NK细胞静息(图8A, p＜0.05)。接下来，进行生存分析，确定免疫细胞高表达组和低表达组之间的OS是否存在差异。高表达组巨噬细胞M0的预后较低表达组差，而其他高表达的免疫细胞，如B细胞、巨噬细胞M2、T细胞CD4+ naive、T细胞CD8+、T细胞滤泡辅助细胞和T细胞调节性T细胞（Tregs）的预后较好(图8B-H, p＜0.05)。考虑到目前对个性化免疫治疗的需求日益增加，我们进一步使用ssGSEA定量分析高低风险组的免疫细胞及其相关功能。低风险组B细胞、CD8+ T细胞、Tfh细胞、肿瘤浸润淋巴细胞的ssGSEA评分显著升高，但高风险组中的巨噬细胞ssGSEA评分显著升高(图8I)。此外，我们观察到两组之间趋化因子受体、免疫检查点、细胞溶解活性、炎症促进、副炎症、T细胞共刺激和I型IFN_response的免疫功能评分存在显著差异(图8J)。随后，我们分析了免疫检查点相关基因在高低风险组之间的表达水平和差异。结果显示，除了NRP1、PDCD1LG2、CD44和CD276外，所有免疫检查点基因在低风险组中的表达水平均高于高风险组(图8K)。上述发现可能为HNSCC患者的免疫治疗提供创新靶点。

7.药物敏感性分析

目前，HNSCC的药物治疗仍有很大的差距，这迫使我们寻找潜在的治疗药物。药物敏感性分析是实现癌症患者个性化治疗、推动精准医疗发展的重要手段。为此，我们计算高低风险组中不同药物的IC50，筛选出两组间敏感性有差异的药物。结果显示，与低风险组相比，高风险组患者对AZD3759 (EGFR抑制剂)、达沙替尼(SRC抑制剂)、埃洛替尼(EGFR抑制剂)、福替尼(VEGFR/HGFR抑制剂)、KU-55933 (ATM激酶抑制剂)、PD0325901 (MEK/ERK通路抑制剂)更为敏感，对AZD4547 (FGFR抑制剂)、AZD6482 (PI3Kβ抑制剂)、Bortezomib(蛋白酶体抑制剂)、尼罗替尼(Bcr-abl抑制剂)、Venetoclax (Bcl-2抑制剂)和Sabutoclax (Bcl-2抑制剂)的敏感性低于低风险组（图9）。这些发现也将有助于为高低风险组的人群制定不同的治疗策略，从而促进HNSCC精准医学的发展。

8.一致性聚类分析

为了鉴定和比较HNSCC的分子亚型，我们对7个ERS相关的lncRNA进行了共识聚类分析。基于不同簇数（K）下共识矩阵的热图，我们得出k = 3是保持簇稳定性的最优k值。将TCGA-HNSCC样本分为三组：集群1 (n = 59)、集群2 (n = 153)和集群3 (n = 40)(图10A)。接下来，我们比较了三个集群在OS、免疫细胞浸润水平、免疫检查点基因表达和药物敏感性方面的差异。三个亚组患者的OS存在差异，第2类患者的OS预后较第1类和第3类患者差(p＜0.001)（图10B）。样本亚组与患者风险的对应关系为:第3类均为低危患者，第1类和第2类多为高危预后不良患者（图10C）。PCA和t-SNE分析结果显示，不同亚组样本之间存在显著差异，高低风险组之间存在显著的差异(图10D-G)。随后绘制热图，显示三个亚组免疫细胞的浸润水平，表明簇3免疫细胞浸润水平最高(图11A)。此外，我们评估了三个簇中的免疫检查点基因表达，结果显示NRP1、PDCD1LG2、CD44、CD276和TNFSF9在簇2中高表达(图11B)。最后，通过比较三个亚组患者对197种药物的敏感性，我们确定了84种在不同HNSCC亚组中具有不同敏感性的药物。我们发现第3类HNSCC患者对大多数药物敏感，包括AMG-319 (PI3K抑制剂)、AZD1208 (PIM抑制剂)、AZD4547 (FGFR抑制剂)、EPZ004777 (DOT1L抑制剂)、尼洛替尼(Bcr-abl抑制剂)和osio -027 (mTOR抑制剂)。而第2类患者对达沙替尼(Bcr-abl抑制剂)、PD0325901 (MEK/ERK通路抑制剂)和沙替尼(EGFR抑制剂)更敏感（图12 A-I）。上述分析表明，与其他亚组相比，第3类HNSCC患者可能具有更有利的预后和治疗反应。

9.7个ERS相关lncRNA在HNSCC中的验证

为了进一步研究这7个ERS相关lncRNA在HNSCC中的表达，我们利用qRT-PCR比较了它们在HNSCC组织和正常组织中的表达水平。qRT-PCR结果显示，与配对的正常组织相比，HNSCC组织中AP003774.2、DDX11-AS1、MIR924HG、MIR9-3HG和AL451085.2的表达下调，而ACTN1-AS1和DOCK8-AS1的表达上调(图13A-G)。这些发现与我们前面提到的生物信息学分析结果一致。

【声明】内容源于网络

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