7+ ：入门都能做的单细胞+常规bulk分析

背景：葡萄膜黑色素瘤（UVM）是最常见的眼内恶性肿瘤，预后很差。

方法：本文通过对单细胞分析和TCGA 数据的加权共表达网络分析来鉴定 UVM 中的坏死性凋亡基因。COX回归和Lasso回归用于构建预后模型。然后进行生存分析、免疫微环境分析和突变分析。

单细胞测序数据分析

作者首先分析了UVM的单细胞测序数据集GSE139829，以整合不同的样本。如图2A所示，11个样本之间的整合效果良好，没有明显的批次效应，可用于后续分析。然后我们通过k-Nearest Neighbor（KNN）聚类算法将所有细胞聚成57个聚类（图2B，C）。然后用 "PercateFeatureSet "函数输入68个与坏死相关的基因，最后得到每个细胞中坏死基因的百分比。按坏死基因比例的中位数将细胞分为低坏死和高坏死细胞，并以tSNE图显示（图2D）。然后，根据不同细胞类型的表面标记基因，作者观察它们在不同集群中的表达（图2C），最终确定了7种细胞类型。分别是B细胞、内皮细胞、单核细胞和巨噬细胞、光感细胞、浆细胞、T细胞和肿瘤细胞（图2E）。然后，作者分析了高颈椎病组和低颈椎病组之间的差异表达基因，结果发现了3673个基因

加权共表达网络分析

在TCGA队列中，通过对77个样本的WGCNA分析，得到了与坏死表型相关的基因模块。通过设置软阈值为9，模块基因的最小数量为100，deepSplit为2，并合并相似度低于0.5的模块，共得到14个非灰色模块（图2F）。我们发现，如图2G所示，MEgreen、MEtan、MEbrown与非灰色模块中坏死的得分密切相关。从这三个模块中选出p值<0.0001的基因进行后续分析。

与坏死相关的预后模型的构建和验证

首先，作者从单细胞测序数据分析得到的差异表达基因和从WGCNA得到的与坏死相关的基因的交叉点上收集了773个基因。通过匹配TCGA和GSE84976共存的基因，有692个基因，用于后续分析。在TCGA队列中，通过单变量COX分析，初步得到447个与患者预后相关的基因。当纳入的基因数为6时，基因收缩趋于稳定，得到6个基因KDELR3、IDH2、S100A6、ITPA、PARP8和APRC1B，并用于构建预后模型。用中值将患者分为高风险组和低风险组。在图3C中，作者发现在TCGA训练队列中，高NCPS组的预后很差（P <0.0001）。同样，在GSE84976验证队列中，作者也观察到高NCPS患者的预后明显差于低NCPS患者（P <0.001，图3D）。为了进一步探讨NCPS在评估UVM患者预后的准确性，作者在训练队列和验证队列中都进行了ROC曲线分析。如图3E所示，在TCGA队列中，1、2、3和5年的曲线下面积（AUC）值分别为0.82、0.86、0.91和0.91。在验证队列中，由于1年随访的患者数量较少，作者绘制了2、3和5年时的预后ROC曲线。作者发现，2,3和5年时的曲线下面积分别为0.89、0.95和0.88（图3F）。这表明NCPS在这两个队列中预测病人结局的准确性很高。最后，对模型中的6个基因分别在训练集和验证集中进行PCA分析，发现模型在训练队列和验证队列中都能很好地将UVM患者分组（图3G，H）。

免疫浸润分析和突变态势

如上述分析所示，NCPS各亚组之间的患者结局有明显的不同。为了探索原因并为免疫治疗提供参考，作者探讨了不同组间免疫浸润水平的差异。结果显示，如图4A所示，高NCPS组有更多的免疫细胞浸润，包括巨噬细胞M2和T细胞。接下来，研究了与免疫检查点相关的基因的表达。如图4B所示，大多数与免疫检查点相关的基因，如PDCD1和CTLA4，在高NCPS组有更高的表达水平。作者假设，高NCPS组与较高的免疫浸润程度有关，但免疫检查点基因的高表达可能导致低反应状态，高NCPS组的患者可能从免疫检查点抑制剂中获益更多。随后，作者分别分析了高、低NCPS组的前20个突变基因的突变情况。结果显示，两组中前20个突变基因的突变发生率均为100%。高NCPS组中最明显的突变基因是GNA11，而低GNAQ组中最明显的突变基因是GNAQ（图4C，D）。

6个建模基因的细胞定位

作者进行了单细胞测序分析，探索建模基因在不同细胞类型中的表达。如图5A-G所示，KDELR3主要在肿瘤细胞中表达，IDH2主要在内皮细胞中表达，S100A6主要在光感受器细胞中表达，ITPA主要在内皮细胞和肿瘤细胞中表达，PARP8主要在T细胞中表达，APRC1B主要在内皮细胞中表达。

列线图的构建

为了更好地评估UVM患者的风险，作者结合临床数据和NCPS值构建了一个列线图。如图6A所示，根据患者 "TCGA-VD-AA8R "的性别、年龄、T分期、总分期和NCPS评分，该患者在1、3和5年内的死亡率估计为0.015、0.11和0.42。该列线图可以更好地评估患者的风险并指导后续的临床决策。为了进一步评估该列线图的准确性，进行了预后ROC分析。结果显示，1、3、5年的曲线下面积（AUC）分别为0.91、0.94和0.78（图6B）。作者还进行了决策曲线分析，即通过计算每个临床特征和None的横轴的面积来评估临床决策价值。结果显示，该列线图的效果优于其他临床指标，说明该列线图在预测患者预后方面有良好的效果，可以指导临床决策（图6C）。

ITPA的生存分析

在COX回归和Lasso回归分析中，ITPA的HR值最高，所以作者进一步对ITPA进行生存分析。结果显示，ITPA高表达的患者的预后明显比ITPA低表达的患者差（P<0.001，图7）。