今天小编和大家分享一篇24年发表在JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR MEDICINE（IF:5.3）杂志的文章《Exploration of shared gene signatures and molecular mechanisms between type 2 diabetes and osteoporosis》。作者通过GEO数据库分析2型糖尿病和骨质疏松发病机制中的关键基因，从而确定可能治疗2型糖尿病和骨质疏松共同发病的患者的潜在治疗靶点。
背景：
2型糖尿病（Type 2 diabetes，T2D）是一种慢性疾病，可导致严重的并发症，如肾病、心血管疾病、神经病变和视网膜病变。临床和流行病学证据表明，T2D 与骨质疏松症（Osteoporosis，OP）之间存在关联。值得注意的是，终末期糖尿病和骨质疏松症通常同时存在，并且都受到衰老的影响。研究表明，20%-60%的 T2D患者会发展成OP。OP的诊断标准依赖于骨矿物质密度降低和/或易发生脆性骨折。OP是一种以骨密度降低和骨微结构减少为特征的全身骨骼疾病，会增加骨的脆弱性和易骨折性。值得注意的是，T2D会导致骨强度增加，极易发生骨折。此外，与普通人群相比，T2D患者发生脆性骨折后的发病率和死亡率都会增加。
随着基因芯片技术的发展，研究人员可以快速检测与各种疾病相关的多个基因的表达数据。加权基因共表达网络分析（Weighted gene coexpression network analysis ，WGCNA）是一种流行的生物信息学方法，可有效分析基因与表型之间复杂的相互作用。WGCNA可将基因组织成共同表达模块，从而建立样本特征与基因表达变化之间的关键关系。我们试图利用WGCNA找出基因簇，包括OP和T2D之间存在相关性和联系的共有基因。这种方法已在多种生物情况下进行了有效测试，可识别与各种疾病表型相关的共同风险基因和通路。
在本研究中，我们旨在利用基因表达总库（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库中广泛而丰富的数据，识别与T2D和OP相关的共表达模块和基因。我们利用WGCNA构建了一个全面的基因共表达网络，从而识别了重要的模块和关键基因。据我们所知，这是一项首次通过系统生物学方法确定T2D和OP共享基因特征的研究。
方法：
1.GEO数据集；
2.T2D中mRNA的鉴定与分析；
3.OP 中mRNA的鉴定和分析；
4.T2D和OP的共表达模块分析；
5.T2D和OP的共同基因特征；
6.T2D和OP的独特基因特征；
7.T2D和OP中miRNA的鉴定和分析；
8.T2D和OP中共享miRNA靶基因网络的鉴定与分析；
9.T2D患者体内PDIA6和SLC16A1的表达分析；
10.PDIA6和SLC16A1抑制胰岛素分泌和胰腺β细胞系的增殖。
研究结果：
1.GEO数据集
四个GEO数据集：GSE15932、GSE148961、GSE62402和GSE201543
Table 1 GEO数据集信息
2.T2D中mRNA的鉴定与分析
通过分析8个正常样本和8个T2D样本之间的差异表达谱，发现了60个与T2D相关的mRNA，如热图和火山图所示（图 1A、B）。富集分析表明，这些mRNA参与了各种生物过程。值得注意的是，发现了三个与T2D相关的BP，即“中性粒细胞胞外陷阱形成”、“利什曼病”和“破骨细胞分化”（图 1C）。上调的差异表达mRNA的BP包括“阿米巴病”、“谷胱甘肽代谢”、“利什曼病”、“中性粒细胞胞外陷阱形成”和“破骨细胞分化”（图 1D）。相反，下调差异表达mRNA的包括“流体剪切应力和动脉粥样硬化”、“NOD样受体信号通路”、“核细胞质转运”、“核糖体”和“真核生物中的核糖体生物发生”（图 1E）。
3.OP中mRNA的鉴定和分析
通过分析5个正常样本和5个OP样本的差异表达谱，确定了一组与OP相关的60个mRNA（图 2A,B）。富集分析表明，这些mRNA参与了多种生物学功能。与OP相关的三个主要BP是“基底细胞癌”、“尼古丁成瘾”和“ECM-受体相互作用”（图 2C）。与上调的差异表达mRNA相关的BP包括“基底细胞癌”、“ECM-受体相互作用”、“尼古丁成瘾”、“原发性免疫缺陷”和“T细胞受体信号通路”（图 2D）。相反，下调的差异表达mRNA则富集于“2-氧代羧酸代谢”、“溶酶体”、“泛酸和CoA生物合成”、“蛋白酶体”和“蛋白质输出”（图 2E）。
4.T2D和OP的共表达模块分析
通过将WGCNA应用于GSE15932，发现了六个模块，每个模块用不同的颜色表示。根据斯皮尔曼相关系数绘制了模块-性状关系热图，以评估每个模块与疾病之间的关联（图 3A、B）。在这些模块中，“蓝色”、“粉色”、“绿色”和“灰色”模块与T2D呈显著正相关（蓝色模块：r = 0.006，p = 0.006；粉色模块：r = 0.04，p = 0.04；绿色模块：r = 0.77，p = 5e-04），因此被选为T2D相关模块。同样，在GSE62402中也发现了九个模块，其中“绿色”模块是唯一一个与OP正相关的模块（r = 0.73，p = 0.02）（图 3C、D）。
5.T2D和OP的共同基因特征
共有43个基因在与T2D和OP正相关的模块中重叠，被定义为基因组1（GS1）（图 4A）。这些基因与这两种疾病的发病机制密切相关。为了进一步研究GS1 的潜在功能，我们进行了GO富集分析。分析表明，GO BP、CC 和MF的前三位显着富集词分别是“RNA修饰”、“U2snRNP”和“异构酶活性”（图 4B）。这一发现证实了这些成分在T2D和OP中的重要参与。
6.T2D和OP的独特基因特征
利用MCODE和TARGET分析提取了四个基因群。在这些聚类中，发现两个基因（PDIA6和SLC16A1）在T2D和OP之间重叠；这两个基因组成了一个基因组，称为基因组2（GS2）（图 5A）。为了研究这些DEGs之间的潜在功能联系，DEGs主要涉及“对食物的反应”、“内质网伴侣复合体”和“肽二硫化物氧化还原酶活性”等过程（图 5B）。
7.T2D和OP中miRNA的鉴定和分析
通过评估正常样本和T2D样本之间的差异表达谱，发现60个miRNA与T2D相关（图 6A、B）。同样，通过分析正常样本和OP样本之间的差异表达谱，确定了与OP相关的60个miRNA（图 6C、D）。
8.T2D和OP中共享miRNA靶基因网络的鉴定与分析
基于GEO数据库，我们获得了这些共有miRNA在疾病中的表达数据。结果显示，在T2D中，18个miRNA表达上调，21个miRNA表达下调。在OP中，183个miRNA表达上调，86个miRNA表达下调。值得注意的是，有6个miRNA在T2D和OP中重叠：hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-150-5p和hsa-miR-5003-3p。在T2D中，miRNA靶向了833个mRNA，而在OP中，iRNA靶向了2394个mRNA。在6个重叠的miRNAs中，PDIA6和SLC16A1这两个基因是靶标。因此，我们构建了一个由6个miRNA和38个mRNA组成的全面的miRNA-mRNA网络（图 7A），以及一个交互作用图来说明35个靶基因之间的关系（图 7B）。最后，建立了一个PPI网络来分析35个靶基因（图 7C）。
9.T2D患者体内PDIA6和SLC16A1的表达分析
为了研究PDIA6和SLC16A1在糖尿病中的意义，我们检测60例T2D患者和60例健康对照者的血液标本中PDIA6和SLC16A1的表达。qRT‐PCR分析显示，与健康志愿者相比，糖尿病患者PDIA6和SLC16A1 mRNA水平显著上调(图8A,B)。此外，我们发现PDIA6和slc16a1的表达与血糖水平之间存在正相互作用(图8C,D)。
10.PDIA6和SLC16A1抑制胰岛素分泌和胰腺β细胞系的增殖
为了阐明这些基因的功能作用，我们在MIN6细胞中过表达或沉默PDIA6和SLC16A1。转染PDIA6和SLC16A1质粒或siPDIA6和siSLC16A1后，与各自的对照组相比，PDIA6和SLC16A1的表达分别显著上调或下调(图9A)。值得注意的是，与siPDIA6#1和siSLC16A1#1相比，siPDIA6#2和siSLC16A1#2的效率更高，因此可以用于后续的实验。过表达PDIA6和SLC16A1可显著抑制MIN6细胞集落的形成，而抑制PDIA6和SLC16A1表达可逆转这种作用(图9B)。此外，CCK‐8实验显示，与对照组相比，上调PDIA6和SLC16A1的表达可显著抑制MIN6细胞的增殖，而抑制PDIA6和SLC16A1的表达则表现出相反的效果(图9C)。流式细胞术分析显示，过表达PDIA6和SLC16A1增加了MIN6细胞的凋亡率，而低表达PDIA6和SLC16A1则产生相反的效果(图9D)。最后，我们观察到，与对照组相比，PDIA6和SLC16A1的过表达显著降低了暴露于葡萄糖的MIN6细胞的胰岛素分泌水平。相反，抑制PDIA6和SLC16A1的表达可显著增加胰岛素分泌(图9E)。由此可见，下调PDIA6和SLC16A1的表达可促进胰腺β细胞系的胰岛素分泌和增殖。
