今天小编和大家分享一篇2024年6月发表在Scientific Reports（IF:3.8）杂志的文章《Regulatory network analysis based on integrated miRNA-TF reveals key genes in heart failure》。摘要：心力衰竭的病因和病理生理学仍然未知。越来越多的证据表明，异常的 microRNA （miRNA） 和转录因子 （TFs） 表达可能与心力衰竭的发生有关。因此，本研究旨在探讨心力衰竭中的关键 miRNA、TFs 和相关基因，以更好地了解心力衰竭的发病机制，从 GEO 数据库 （GSE59867 、 GSE9128 和 GSE134766）中搜索和下载与心力衰竭相关的 mRNA 芯片数据集，我们使用 R 语言软件分析了差异基因并筛选了两个芯片上常见的差异表达基因。miRNAs 、 TFs 和相应基因之间的二元相互作用和回路由 Pearson 相关系数确定。基于生物信息学构建了 miRNAs、TFs 和靶基因的调控网络。通过比较心力衰竭和无心力衰竭患者的序列，确定了 5 个高甲基化 mRNA 下调的基因和 3 个低甲基化 mRNA 上调的基因。miRNA-TF 基因调控网络由 26 个 miRNA、22 个 TFs 和 6 个基因组成。GO 和 KEGG 分析结果显示，细胞对有机物质的反应、细胞对细胞因子刺激的反应等 BP 术语以及破骨细胞分化、MAPK 信号通路和军团菌病等 KEGG 通路都富集了 DEGs。TMEM87A、PPP2R2A、DUSP1 和 miR-92a 作为心力衰竭的生物标志物具有巨大潜力。mRNA 表达谱和 microRNA-转录因子-基因的综合分析揭示了心力衰竭的调控网络，这可能为其替代治疗提供线索。
背景
心力衰竭是由心脏结构或功能疾病引起的一组临床综合征，导致心输出量绝对或相对减少。流行病学数据表明，发达国家的心力衰竭发病率约为成年人口的1-2%。目前全球有 2250 万例心力衰竭病例，心力衰竭病例数每年增加 200 万例。尽管医疗技术取得了巨大进步，但心力衰竭作为大多数心血管疾病的最后阶段，是唯一一种发病率、发病率和死亡率每年都在增加的心血管疾病。
沉默小RNA 的研究主要遵循两个方向：小干扰 RNA （siRNA） 和 microRNA （miRNA）。siRNA 主要参与 RNA 对靶 mRNA 的干扰，而 miRNA 更多地参与调节基因表达，发挥重要作用。siRNA可通过 RNA 干扰沉默复合物选择性减少特异性蛋白的产生。在机械上，siRNA 与 RNA 诱导的沉默复合物的多酶复合物结合，然后定位于 mRNA 上的特定位点，通过核酸内切酶和核酸外切酶活性降解靶标 mRNA。例如，在舒张性心力衰竭大鼠模型中，通过施用靶向 SOCS3 （AAV9-SOCS3 siRNA） 的腺相关病毒介导的 RNA 干扰来沉默 SOCS3 基因，可显著降低心肌纤维化和炎症反应，并改善心脏功能。因此，RNA 干扰 在治疗心力衰竭方面具有很大的前景。miRNA 是一种长度为 22-25 nt 的化合物非编码 RNA 分子，在各种细胞组织中广泛表达。miRNA 结合 3′UTR、5′UTR 和 CDS6 中的 mRNA 序列，从而在转录后水平抑制蛋白质翻译或基因表达，从而精确调节细胞生长、分化和细胞凋亡。Lu 等人发现，在心房颤动离子通道重建过程中，miR-328 通过调节 Ca2+ 通道的靶基因参与心房纤维化的重塑。此外，疾病相关 miRNA 可以作为切入点，通过生物遗传信息原理确定与 miRNA 相互作用的基因和转录因子 （TFs），构建相应疾病的混合共调控网络。
TFs是基因表达的关键调节因子，通过与靶基因启动子的特定 DNA 序列结合来增强或抑制基因转录。如果 TF 和 miRNA 共同调节编码基因，而转录因子反过来调节该 miRNA 的编码基因，则在转录因子、 miRNA 和编码基因之间建立前馈环 。或者，当 TFs 调节 miRNA 的基因转录并且成熟 miRNA 在转录后水平抑制 TFs 的翻译时，就会建立调节反馈回路 。研究表明，哺乳动物中的数百个共调节模块可能由 miRNA 和转录因子组成。此外，实验证实了多个前馈和反馈功能回路，包括中脑神经元发育中转录因子 PITX3 和 miR-133b 之间的反馈回路，乳腺癌中细胞周期基因 CCND1 和 miR-17/20 形成的反馈回路，以及 TP53/miR-106b/E2F 与细胞增殖功能相关的前馈回路。鉴于 miRNA 和 TF 共调控的普遍性以及 mRNA 和 TFs 在复杂疾病中的重要作用，我们提出了影响基因表达的 miRNA 和 TFs 共调控网络来研究心力衰竭。
本项目以miRNAs 和 TFs 的共调控为切入点，开发并应用生物信息学方法，整合实验和预测数据，全面准确地构建了 miRNA、TFs 和心力衰竭基因之间形成的共调控前馈环模块，建立了共调控 miRNA-TF 网络。通过对调控网络的统计分析，确定了在心力衰竭中起核心作用的 miRNA 和基因。这是首次在系统层面对心力衰竭的发病机制和过程进行研究，为心力衰竭的诊疗提供了理论依据，为研究复杂疾病提供了新的思路和方法。
方法
1.从 mRNA 数据集中下载GSE5986715，GSE134766数据集和GSE9128；
2.差异表达基因的筛选；
3.样本相关性分析；
4.基因功能富集分析；
5.蛋白质相互作用网络分析；
6.TF-miRNA-mRNA 调控网络。
7.肿瘤异质性、干性和基因突变分析
8.RNA修饰、肿瘤免疫微环境和药物敏感性分析
9.统计分析
研究结果
1.文章思路梳理：
如下图所示，本文选择了两个mRNA数据集，一个甲基化数据集，通过不同数据集中差异基因和甲基化基因筛选，差异基因的富集分析，PPI网络构建等探究了miRNA 和mRNA对心力衰竭的发病机制和过程的影响。
Fig 1 流程图
2.筛选差异表达基因（DEG）
经GSE59867 数据集筛选，从心力衰竭患者的左心室组织中获得了613个上调和 830 个下调的差异基因；经GSE9128数据集筛选，从高血压心力衰竭患者的左心室组织中获得了 426 个上调和 503 个下调的差异基因 （p < 0.05， |logFC|≥ 1.2），如表1所示。基因表达受表观遗传机制以及基因间相互作用的调节。此外，在 GSE134766 个数据集中共获得 7049 个高甲基化和 14,122 个低甲基化位点，如表 1 所示。之后，分别确认了 3945 个具有高甲基化位点的相应基因和 6150 个具有低甲基化位点的相应基因。差异基因的火山图谱和热图如图2所示。
表1不同数据集中差异基因筛选情况
Fig 2 差异基因筛选的火山图和热图
将 GSE59867 和 GSE9128 数据集中上调和下调的差异表达基因相交，最终获得了 31 个上调的差异表达基因和 30 个下调的差异表达基因（图3A）然后选择了不同表达基因与不同修饰甲基化位点的交集，最后获得高甲基化 mRNA 基因，包括 INADL、LEPROTL1、NELL2、PSME4 和 TMEM87A；3个低甲基化上调的 mRNA，包括 NPL、PTAFR 和 RHOB，GSE59867和 GSE9128 数据集的这8个差异表达基因的具体表达水平如图3B所示。
Fig 3 差异基因交集图和表情情况图
3.差异表达基因的 GO 功能富集分析
对选定的差异甲基化和差异表达交叉基因，进行 GO 和 KEGG 富集分析。基因的功能可分为三类：生物过程 （BP）、分子功能 （MF） 和细胞成分 （CC）。
结果显示，在 GO 项的生物过程类别 （GO-BP） 中，心力衰竭患者的常见差异基因主要集中在细胞对有机物的反应、细胞对细胞因子刺激的反应、先天免疫反应的正调节、免疫反应调节信号通路和抑制反应（图 4A）。GO 细胞成分类别 （GO-CC） 中的靶基因富集在三级颗粒膜、网格蛋白衔接子复合物和 AP 型膜外壳衔接子复合物、网格蛋白外壳以及蛋白质丝氨酸苏氨酸磷酸酶复合物中（图4B）。GO 分子功能 （GO-MF） 类别富集于参与蛋白激酶结合、白细胞介素-1 受体结合、蛋白质丝氨酸苏氨酸磷酸酶活性、激酶结合和 R-SMAD 结合的基因中（图 C）。4KEGG 结果显示，破骨细胞分化、MAPK 信号通路、军团菌病、细菌感染和 B 细胞受体信号通路占富集基因的大部分（图5）。
Fig 4 GO富集分析
Fig 5 KEGG富集分析
4蛋白质相互作用网络分析
为进一步探究 HF 相关差异表达基因与其他基因的相互作用，首先使用 STRING 单独分析每个基因的蛋白质相互作用，并提取并保存每个基因编码的蛋白质的相互作用记录，以中等可靠性 （0.40） 为最低相互作用得分。结果表明，枢纽基因包括 FOS、FPR2、IL1B、DUSP1 和 TLR5 （图6）. 缺乏相关研究导致注释数量不足;然而，少量相互作用的蛋白质并不表示由基因编码的蛋白质具有较弱的调节作用。经过深入观察，我们发现一些因素已被证明在 HF 的发病机制中起重要作用，例如 RHOB 和 TMEM87A。
Fig 6 PPI分析
5.TF-miRNA-mRNA 调控网络
根据 miRMap 、 miRanda 、 miRDB 、 TargetScan 和 miRTarBase 数据库，发现了与上述差异甲基化和差异表达交集基因相对应的 miRNA （至少对于三个数据库中存在的相关对）。共提取了 259 对 miRNAs 和基因，用于后续构建 TF-miRNA-mRNA 调控网络。根据 TransmiR v2.0 数据库 （http://www.cuilab.cn/transmir） 中基于不同类别的 TF miRNA 调控数据水平数据，共发现 780 对 miRNAs 和 TFs。然后，鉴定这些 miRNA-基因关系对中的基因，并根据 ENCODE 数据库鉴定相应的基因-TF 关系，共 709 对。基于二元相互作用和电路之间的关系，我们构建了 miRNA-TF 基因调控网络（图 D）。7）. 最终整合网络包含 26 个 miRNA（hsa-mir-143、hsa-mir-25、hsa-mir-30a、hsa-mir-30b、hsa-mir-30d、hsa-mir-30e、has-mir-32、has-mir-363、has-mir-593、hsa-mir-92a、hsa-mir-92b、hsa-let-7a、hs-let-7b、hs-let-7d、has-let-7e、has-let-7f.、hs-let-7g、hs-let-7i、hs-miR-125a、hs-mir-125b、hs-mi-149、hs-mir-19a、hsa-mir-19b、hs-mir-223、hs-mi-92a-2、hs-mi-642a）、22 个 TFs（EZH2、MAX、MYC、JUN、EGR1、RUNX3、RELA、BRCA1、MEF2A、STAT3、EGR1、KDM5B、GATA3、KDM5B、NFATC1、CEBPB、ELK1、 MXI1、SP1、NANOG、TAL1、RUNX3）和六个基因（NELL2、TMEM87A、LEPROTL1、PTAFR、NPL、RHOB）。心力衰竭 miRNA-TF 基因网络中排名前5位的关键调节因子为 TMEM87A、RHOB、PTAFR、MYC 和 NPL，分别与 22 、 21 、 19 、 12 和 11 个相应靶点直接相关。
Fig 7 TF-miRNA-mRNA 调控网络
6.结论
本文基于公共数据库的数据集，利用生信分析确定了TMEM87A、PPP2R2A、DUSP1 和 miR-92a 作为心力衰竭的生物标志物具有巨大潜力，mRNA-microRNA-转录因子的综合分析揭示了心力衰竭的调控网络，这可能为心力衰竭的替代治疗提供更多线索和参考。
