背景
方法：
结果：
1、差异表达的锰代谢和免疫相关基因的筛选及功能分析
2、通过无监督聚类构建四个子类型
基于锰代谢和免疫相关差异表达基因（DEGs）的聚类分析，将整个队列分为四种不同的亚型，分别命名为聚类 1、2、3 和 4（图 3A）。t-SNE 分析显示了样本的分布情况（图 3B）。进一步分析了四种亚型的预后差异，结果表明四个亚型之间的生存预后具有显著统计学差异（P < 0.001），如图 3C 所示。其中，聚类 1 的患者总生存时间最长，提示其预后更为有利。不同亚型的肿瘤微环境变化如图 3D-G 所示。聚类 2 的免疫评分和 ESTIMATE 评分显著高于其他亚型，而聚类 4 的肿瘤纯度最高，这可能与其较差的预后相关。免疫检查点的分析显示，聚类 3 的患者在大多数免疫检查点基因上的表达水平显著高于其他亚型（图 3H）。根据 GSVA 分析结果（图 3I），与肿瘤进展相关的信号通路（如粘着斑、转化生长因子-β（TGF-β）信号通路及细胞外基质（ECM）受体相互作用）在聚类 2 和聚类 3 中显著活跃，而代谢相关通路（如丙酮酸代谢、色氨酸代谢和脂肪酸代谢）主要集中在聚类 1 和聚类 4。
3、MIR 的建立和验证
单变量 Cox 回归分析表明，在 TCGA 队列的胃癌（GC）患者中，有 22 个基因与总体生存（OS）显著相关（图 4A）。其中，LGR6 被鉴定为 GC 的保护因子（HR < 1，P < 0.01），其余基因则被视为危险因子（HR > 1，P < 0.01）。通过 LASSO 回归分析，筛选出了 13 个与锰代谢和免疫相关的基因（MIRGs）（图 4B、C）。进一步计算了这 13 个基因的回归系数。在这些基因中，5 个被归类为锰代谢相关基因（CD36、VCAN、SERPINE1、SLC24A2、RAG2），3 个为免疫相关基因（APOH、LGR6、CER1），而另有 5 个同时属于锰代谢和免疫相关基因（VTN、NPR3、GRP、RNASE3、EGF）。基于特定公式计算患者的风险评分： RiskScore = （0.086 × CD36） + （0.024 × VCAN） + （0.182 × SERPINE1） + （0.065 × VTN） + （0.011 × NPR3） + （0.099 × APOH） + （0.205 × GRP） + （0.027 × SLC24A2） + （-0.108 × LGR6） + （0.304 × RNASE3） + （0.171 × CER1） + （0.372 × EGF） + （1.075 × RAG2）。
以 TCGA 队列的中位风险评分为阈值，将训练集中的胃癌（GC）患者分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier 生存分析显示，高风险组患者的死亡率更高，总生存期显著缩短（图 4D）。训练队列中样本的生存状态和风险评分如图 4E、F 所示。图 4G 展示了两个亚组之间 13 个基因的表达差异。通过时间依赖性 ROC 曲线评估 MIRG 的预测效率，1 年、2 年和 3 年的曲线下面积（AUC）分别为 0.671、0.719 和 0.739（图 4H）。风险评分的 AUC 达到 0.657，是所有临床特征中预测能力最强的。在 GSE66229 数据集中，样本的风险评分采用与 TCGA 数据集相同的方法计算。为验证在 TCGA 数据集中构建的 MIRG，GSE66229 数据集中的患者同样根据相同的阈值分为高风险组和低风险组。验证队列的结果与训练队列一致：高风险组患者的生存期显著缩短（P < 0.001）（图 4I）。验证队列中样本的生存状态和风险评分如图 4J、K 所示。图 4L 显示了高风险组和低风险组之间 13 个基因的表达差异。时间依赖性 ROC 曲线显示出较好的敏感性和特异性水平，1 年、2 年和 3 年的 AUC 值分别为 0.718、0.610 和 0.610（图 4M）。风险评分的 AUC 达到 0.719，表明 MIRGs 在预测 GC 个体预后方面具有较高的有效性。
4、风险评分相关预后列线图的开发
为了提高对胃癌（GC）患者预后的预测准确性和临床应用价值，开发了一种列线图，结合了风险评分和其他预后指标（图 5A、D）。总分与患者 1 年、2 年和 3 年的生存率呈负相关。校准曲线显示，预测的 1 年、2 年和 3 年生存率与实际生存率之间具有良好的一致性（图 5B、E）。此外，列线图的 ROC 曲线分析表明，其 AUC 值在训练集中为 0.725，在验证集中为 0.778（图 5C、F）。这些 AUC 值高于性别、年龄、风险评分和 TNM 分期的对应值，表明列线图在预测 GC 患者生存率方面具有显著的优势和应用潜力。
5、MIGG 的免疫学特征及药物敏感性分析
在 TCGA-STAD 数据集中，利用 CIBERSORT 算法计算免疫相关评分，以区分不同风险亚组的免疫浸润特征。高风险组患者在多项免疫功能上表现出显著增强，包括 APC 共刺激、循环趋化因子受体（CCR）、人类白细胞抗原（HLA）、免疫检查点、副炎症、I 型 IFN 反应、II 型 IFN 反应以及 T 细胞共抑制等（图 6A）。免疫浸润分析显示，与低风险组患者相比，高风险组患者具有更高的单核细胞和 M2 巨噬细胞比例（图 6B），反映了不同风险亚组之间显著的免疫学特征差异。我们进一步从 GDSC 数据库中分析了 198 种药物的敏感性（详见补充表 S10），并比较了低风险组和高风险组之间临床相关药物的 IC50 值（图 6C-J）。此外，还分析了药物 IC50 值与风险评分之间的关系（图 6K-R）。结果显示，随着风险评分的增加，5-氟尿嘧啶、阿法替尼、奥希替尼和紫杉醇的 IC50 值呈上升趋势，而西地尼布、Dactolisib、达沙替尼和星形孢菌素的 IC50 值则呈下降趋势。药物敏感性分析表明，高风险组患者可能更倾向于从西地尼布、Dactolisib、达沙替尼和星形孢菌素治疗中获益，而低风险组患者则更有可能从 5-氟尿嘧啶、阿法替尼、奥希替尼和紫杉醇的治疗中受益。这些结果为不同风险亚组患者的个性化治疗提供了重要参考。
6、免疫治疗效果评价及体细胞突变分析
我们进一步分析了患者之间微卫星状态的分布（图 7A）。在高风险组和低风险组中，微卫星稳定性（MSS）的个体占比更高。而低风险组中微卫星不稳定（MSI）的个体比例（36%）高于高风险组（29%）。此外，MSI 高（MSI-H）状态患者的风险评分显著低于 MSS 和 MSI 低（MSI-L）状态患者（图 7B），这表明免疫治疗可能更适合低风险组的胃癌（GC）患者。对于免疫治疗的敏感性分析发现，TIDE 评分较高的患者通常对免疫治疗的响应较差。图 7C 显示，低风险组患者的 TIDE 评分显著升高，这可能表明其免疫治疗效果较低。随后，我们评估了不同风险亚组 GC 患者的免疫原性评分（IPS）（图 7D-G），结果发现，与高风险组相比，低风险组的 IPS-CTLA4 阻滞剂评分显著更高，这表明低风险组患者可能更有可能从免疫检查点抑制剂（ICIs）中获益。此外，低风险组的免疫检查点基因表达水平低于高风险组（图 7H）。我们还计算并分析了每个样本的肿瘤突变负荷（TMB）。结果显示，风险评分与 TMB 呈负相关，高风险组的 TMB 显著低于低风险组（图 7I）。瀑布图展示了高风险组（图 7J）和低风险组（图 7K）中突变频率最高的前 20 个基因，为两组患者的基因突变特征提供了更直观的信息。
7、单细胞 RNA 测序数据和NPR3 的单基因分析
从 GSE184198 的 scRNA-seq 数据中获得了 22,240 个细胞的转录谱，并通过 UMAP 方法将这些细胞分为 16 个簇（图 8A）。每个簇的前 5 个标记基因的表达水平以热图形式展示（图 8B），同时在散点图中可视化了各簇标记基因的分布情况（图 8C）。这 16 个细胞簇进一步归类为 7 种细胞类型，包括 T 细胞、树突状细胞、B 细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和肥大细胞（图 8D）。
进一步分析 NPR3 基因的表达和分布（图 8E、F）发现，NPR3 主要富集于内皮细胞中。在胃癌（GC）组织中，NPR3 的表达显著降低（图 8G）。与 NPR3 表达低的患者相比，NPR3 高表达的患者预后更差（图 8H）。ROC 曲线分析显示，NPR3 基因的 AUC 为 0.636，表明其对预后预测具有一定的准确性（图 8I）。此外，NPR3 基因与多种免疫细胞密切相关，尤其是肥大细胞、巨噬细胞和 NK 细胞（图 8J）。这些结果揭示了 NPR3 在 GC 中的潜在生物学意义和临床价值。
8、NPR3 在 GC 中的功能验证
研究表明，NPR3 基因与透明细胞肾癌 (41)、骨肉瘤 (42)、结直肠癌 (43) 和肝细胞癌 (44) 的发病机制密切相关。然而，NPR3 在胃癌（GC）中的具体作用尚未得到充分探讨。为此，我们通过细胞实验进一步研究了 NPR3 对 GC 的影响。蛋白质印迹结果显示，NPR3 在 GC 细胞系中的表达水平显著降低（图 9A）。将 p-NPR3 转染至 AGS 和 SGC7901 细胞系中，并通过蛋白质印迹验证了转染效率（图 9B、C）。实验结果表明，NPR3 过表达对 AGS 细胞活力无显著影响（图 9D），但显著增强了 SGC7901 细胞的活力（图 9E）。集落形成实验显示，NPR3 的上调显著促进了 SGC7901 和 AGS 细胞系的集落形成（图 9F、G）。迁移实验结果表明，NPR3 表达的增加显著提升了这两种细胞系的迁移能力（图 9H、I）。根据 EdU 测定的结果，NPR3 的上调显著增强了 SGC7901 和 AGS 细胞系的增殖能力（图 9J、K）。这些结果揭示了 NPR3 在 GC 中潜在的生物学功能和其对肿瘤细胞行为的影响。
