今天小编和大家一起分享一篇2022年6月发表在Frontiers in Neurology杂志的文章《Integrated Analysis of Immune-Related circRNA-miRNA-mRNA Regulatory Network in Ischemic Stroke》。
背景
中风是全世界死亡和残疾的主要原因。尽管近年来中风死亡率有所下降，但由于人口增长和老龄化，患病率有所增加。它是脑血管循环的突然中断，包括两种亚型：缺血性卒中（IS）和出血性卒中。缺血性卒中更常见，占所有卒中的87%。最有效的IS治疗方法是使用重组组织纤溶酶原激活剂（rTPA）进行静脉溶栓。然而，这种治疗方案的缺点是只有3-4.5小时的治疗窗口。目前，诊断 IS 主要依赖于典型的临床症状和脑影像学检查。然而，大约50% 的IS在早期影像学诊断中缺乏特异性。此外，卒中的潜在机制尚未完全确定，目前尚无用于临床的IS血液生物标志物。因此，探索IS的新生物标志物至关重要，这有助于全面了解该疾病的病因和病理生理学，并有助于早期诊断和治疗。以前，miRNA和lncRNA已被提议作为可能的卒中生物标志物。相比之下，研究人员最近开始研究circRNA在IS中的作用，并寻找与 IS 相关的circRNA生物标志物。
环状RNA（circRNA）是一种高度保守且稳定的非编码 RNA，具有环状结构，不含5'端帽和3'末端多聚（A尾。据报道，CircRNA广泛参与IS过程，包括参与缺血性脑损伤、抑制细胞凋亡和神经炎症以及保护血脑屏障。此外，外泌体可以携带 circRNA 穿过血脑屏障，使 circRNA 稳定存在于外周血中，使 circRNA 有望成为 IS 的新型诊断和预后生物标志物 （14）。最近的一项研究报告称，IS 患者血浆中 CircOGDH 表达上调，且 CircOGDH 表达与半影大小呈正相关。Li等人检查了急性卒中患者和健康对照者的循环血液 circRNA 表达谱，并鉴定了 IS 患者中差异表达的 circRNA。这些先前的研究表明，IS患者的外周circRNA表达水平失调。Zuo等人报道，外周血细胞中 circCDC14A 的下调可减轻 tMCAO 小鼠卒中急性期的脑损伤。因此，调节失调的circRNA水平可能会逆转IS的病理过程。circRNA 可以作为竞争性内源性 RNA （ceRNA） 发挥相应的功能，这意味着 circRNA 可以通过碱基互补性像海绵一样与 miRNA 竞争性结合，从而影响靶基因并调节编码转录本的水平。最近的一项研究报告称，hsa_circ_0045932 （circUSP36） 通过 miR-139-3p/SMAD3/Bcl2 信号转导轴减轻缺血性卒中损伤。Xu等人发现 circSKA3 可以竞争结合 has-miR-6796-5p，从而调节 MMP9 促进缺血性卒中进展。然而，仍有许多失调的 circRNA 在 IS 中的作用尚未被报道。因此，circRNA作为ceRNA参与IS过程的潜在作用目前尚不清楚。
我们的研究对来自基因表达综合（GEO）数据库的 IS 微阵列数据进行了全面分析。最终，我们在IS中发现了一种新的潜在circRNA-miRNA-mRNA调控网络。此外，我们筛选出ceRNA网络中的免疫相关枢纽基因，并进一步构建了免疫相关的ceRNA子网络。我们的研究为IS中ceRNA免疫调控的分子机制提供了新的视角。
方法
1.微阵列芯片数据
从基因表达综合 （GEO） 数据库 （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） 下载微阵列数据集（GSE195442、GSE117064 和 GSE58294）。数据集GSE195442基于GPL31275安捷伦085499_SBC人 ceRNA 微阵列。GSE195442中的所有样本都包含在我们的研究中，包含来自 10 名 IS 患者和 10 名对照者的血浆外泌体样本。数据集GSE117064基于GPL21263 3D-Gene Human miRNA V21_1.0.0。它包含 1785 份血清样本，其中 189 名男性参与者是从 >65 岁的个体中收集的，包括 84 名 IS 患者和 105 名对照，并被纳入我们的研究。数据集GSE58294基于 GPL570 [HG-U133_Plus_2] Affymetrix 人类基因组 U133 Plus 2.0 阵列。我们的研究纳入了 23 名缺血性卒中患者（发病 5 小时）和 23 名GSE58294对照组的外周血样本。此外，基于Illumina HumanRef-8 v3.0表达芯片GPL6883 GSE16561，包含来自39名IS患者和24名对照者的外周血样本，进行了验证。本研究不需要伦理委员会的批准或知情同意，因为数据是从GEO数据库公开获得的。
2.差异表达分析
DEcircRNA、DEmiRNA 和 DEmRNA 通过 R 软件中的“limma”包进行筛选 （22）。阈值设置为 p 值 <0.01 和 |log2倍变化|>1.2 从GSE195442中选择 DEcircRNA。接下来GSE117064，用调整后的p值<0.05和|log2倍变化|>2 并设置为选择 DEmiRNA 的阈值。最后，通过调整后的p值<0.05的临界点和|log2倍变化|>1 GSE58294。
3.基因本体论和KEGG富集分析
R 中的“clusterProfiler”包被应用于基因本体论 （GO） 和京都基因和基因组百科全书 （KEGG） 通路富集分析 （23）。低于 0.05 的 p 值被认为具有统计学意义。
4.PPI网络构建与枢纽基因鉴定
STRING 数据库 （http://string-db.org） 建立了 DEmRNA 的 PPI 网络 （24）。交互得分超过 0.4 被认为具有统计学意义。接下来，将交互网络下载并导入 Cytoscape 软件进行可视化 （25）。然后，通过 cytoHubba 插件 app （26） 分别选择按度数和 MCC 分数排名前 20 的基因。
5.IS中ceRNA网络的构建
我们通过环状 RNA 相互作用组 （CircInteractome） 数据库 （https://circinteractome.nia.nih.gov/） 预测了与 DEcircRNA 相互作用的靶标 miRNA （27）。预测的miRNA通过在线工具Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）通过维恩图与DEmiRNA相交。然后，通过miRDB数据库预测重叠miRNA的靶标mRNA（28），并通过Venny 2.1.0获得预测的mRNAs和DEmRNAs的交集。最后，基于circRNA、miRNAs和mRNAs的表达构建ceRNA网络，并使用Cytoscape软件对结果进行可视化。
6.免疫相关ceRNA子网络的构建
免疫相关基因 （IRG） 来自 ImmPort 数据库 （29）。我们交叉了 IRG、Degree 排名前 20 位的枢纽基因、MCC 排名前 20 位的枢纽基因和 ceRNA 网络中的靶基因，并鉴定了免疫相关的枢纽基因。然后，我们构建了一个免疫相关的circRNA-miRNA-mRNA子网络，并通过Cytoscape软件进行可视化。
7.免疫相关sub-ceRNA网络mRNA的诊断分析
使用独立的外部数据集 GSE16561（包括 39 名 IS 患者和 24 名对照）进行验证。免疫相关 ceRNA 子网中靶基因的有效性通过 R 中的“pROC”包通过受试者工作特征 （ROC） 曲线进行 （30）。此外，通过 t 检验比较 IS 患者和对照组之间免疫相关枢纽基因的 mRNA 表达水平，p 值< 0.05 被认为具有统计学意义。
8.免疫细胞亚型分布的估计
在 R 中使用 CIBERSORT 评估了 46 个样本（23 个对照组对 23 个 5 小时发作的 IS 患者）中不同免疫细胞亚型的相对表达GSE58294 （31）。首先，通过直方图显示46个样本中每种免疫细胞的比例。然后，使用箱线图比较对照组和IS组之间每种免疫细胞亚型的相对表达。最后，使用Pearson相关性进行免疫相关枢纽基因与每个免疫细胞之间的关系，并通过棒棒糖图可视化。
结果
1. IS中DEcircRNA、DEmiRNA和DEmRNA的鉴定
整个研究的流程图如图1所示。在GSE195442数据集中共获得35个DEcircRNA（20个上调，15个下调）（图2A，B）。此外，在GSE117064数据集中鉴定出141个DEmiRNA（99个上调，42个下调）（图2C，D）。此外，在GSE58294数据集中筛选了 356 个 DEmRNA（165 个上调和 191 个下调）（图 2E、F）。DEcircRNA、DEmiRNA 和 DEmRNA 的列表可在补充表 S1–S3 中找到。
2.基因本体论和KEGG富集分析
基因本体论术语分为三大类：生物过程 （BP）、细胞成分 （CC） 和分子功能 （MF）。BP 中的前三个术语包括中性粒细胞活化、中性粒细胞脱颗粒和参与免疫反应的中性粒细胞活化。CC中排名前三的术语包括质膜外侧、特定颗粒和三级颗粒。MF中的前三个术语包含：通道活性，离子通道活性和糖胺聚糖结合（图3A）。KEGG富集途径的结果表明，DEGs主要参与细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt信号通路以及补体和凝血级联反应（图3B）。
3.PPI网络构建与枢纽基因鉴定
DEmRNA的PPI网络由STRING数据库构建并导入Cytoscape软件（图4A）。根据度数评分，排名前20位的基因包括CD19、CCR7、RAG1、OLIG2、ITGA1、FGF9、IDO1、AXIN2、SOX9、TGFA、CD27、NT5E、PROM1、FCRL4、TJP1、NOG、MMP9、MSX1、FGF13和CD79B（图4B）。此外，MCC评分排名前20位的基因包括CD19、CCR7、RAG1、OLIG2、ITGA1、ARG1、SPIB、FGF9、IDO1、AXIN2、SOX9、CD27、NT5E、PROM1、NOG、EBF1、MMP9、MSX1、FGF13和CD79B（图4C）。
4.构建circRNA-miRNA-mRNA调控网络
在CircInteractome数据库中共预测了253个DEcircRNAs的潜在靶标miRNA。然后，从预测的 miRNA 和 DEmiRNA 的交集处获得 9 个重叠的 miRNA（图 5A）。接下来，通过使用miRDB数据库，鉴定了3,693个重叠miRNA的潜在靶基因。随后，通过预测靶基因和DEmRNA的交叉获得了72个交叉的mRNA（图5B）。最后，基于circRNA-miRNA对和miRNA-mRNA对的负调控构建了IS的ceRNA网络，其中包括15个circRNA（图5C）、8个miRNA（图5D）和39个mRNA（图5E）。ceRNA网络如图5F所示。
5.免疫相关ceRNA子网络构建
为了进一步探索IS中免疫相关的ceRNA调控关系，我们在ImmPort数据库中获得了免疫相关基因（IRG），并将IRG与ceRNA网络中的mRNA和DEmRNA的中心基因相交（图6A）。结果，重叠基因FGF9被鉴定为免疫相关枢纽基因，随后构建了IS中的免疫相关ceRNA子网。最后，hsa_circ_0127785和hsa_circ_0075008（在IS中下调）、has-miR-767-5p（在IS中上调）和FGF9（在IS中下调）形成了免疫相关的ceRNA调控网络（图6B）。在独立数据集GSE16561中，验证了 FGF9 在 IS 患者和对照中的表达（图 7A），并且 FGF9 表达与 ROC 曲线分析的 IS 诊断显着相关 （AUC = 0.844）（图 7B）。
6.相对免疫细胞表达
我们通过CIBERSORT分析了每个纳入的GSE58294样本中22个免疫细胞的相对表达，结果显示，纳入的样本中有17种免疫细胞表达。每个样品中免疫细胞亚型的分布如图8A所示。中性粒细胞在所有样本中均记录最高表达，IS患者的表达明显高于对照组（图8B）。此外，还分析了免疫相关枢纽基因FGF9的表达与每种免疫细胞亚型的表达的相关性。结果，FGF9的表达与中性粒细胞水平呈显著负相关（p < 0.001;图8C，D）。
讨论
中风给社会和经济带来了沉重的负担。IS是中风的主要类型。由于溶栓治疗的窗口狭窄且影像学特征经常缺乏特异性，因此识别血液生物标志物以进行快速诊断至关重要。此外，鉴定卒中中的潜在相关基因和筛查circRNA-miRNA-mRNA调控相互作用有助于进一步了解IS的发病机制，并为IS的预防、诊断和治疗提供新的见解。
大量研究表明，circRNA 的异常表达与多种疾病有关。最近的研究表明，circRNA 参与 IS 的转录后调控。Yang等人发现，由细胞外囊泡介导的circSCMH1靶向递送至大脑可改善小鼠和猴子中风后的功能恢复。一项临床试验发现 IS 患者中 circPDS5B 和 circCDC14A 的显著上调。因此，circRNA是IS诊断和预后的一个有前途的新靶点。CircRNA 可以海绵化 miRNA，从而减少 miRNA 对下游靶标基因的调控。然而，ceRNA 在 IS 中的机制尚不完全清楚，越来越多的研究关注 circRNA-miRNA-mRNA 在 IS 中的作用。关于circRNA作为ceRNA在IS中的作用，有足够的空间来扩展进一步的研究。
在这项研究中，我们在 GEO 数据库的表达谱中鉴定了 35 个 DEcircRNA、141 个 DEmiRNA 和 356 个 DEmRNA。然后，我们通过CircIteractome数据库筛选circRNA-miRNA相互作用对，通过miRDB数据库筛选miRNA-mRNA相互作用对。通过对预测的miRNAs和DEmiRNAs进行交叉，并将预测的mRNAs和DEmRNAs进行交叉，最终确定了IS中潜在的circRNA-miRNA-mRNA调控网络，该网络包含15个circRNA（8个上调和7个下调）、8个miRNA（5个上调和3个下调）和39个mRNA（21个上调和18个下调）。
为了了解DEmRNA在IS中的功能，我们进行了基因本体和KEGG通路富集分析。结果，GO的BP模块中中性粒细胞活化显著富集，细胞因子-细胞因子受体相互作用因KEGG通路富集显著富集。富集结果证实了 DEmRNA 的可靠性，因为许多研究表明炎症反应在 IS 发病后的各个阶段起着重要作用，这会影响中风的预后和治疗。因此，我们进一步从ImmPort数据库中下载了免疫相关基因（IRG），以筛选IS中的免疫相关枢纽基因。结果，FGF9作为ceRNA网络中IRGs、PPI枢纽基因和靶基因的交叉点，被鉴定为构建免疫相关ceRNA子网的靶基因。该子网包含 hsa_circ_0127785/hsa_circ_0075008（IS 中下调表达）、has-miR-767-5p（IS 中上调表达）和 FGF9（IS 中下调表达）。在独立数据集GSE16561验证了靶基因FGF9的表达模式。结果，FGF9 在 IS 患者中的表达仍然显着下调，并且 ROC 曲线表明具有良好的诊断效果 （AUC = 0.844）。
CIBERSORT算法显示，IS发作后中性粒细胞水平显著增加，与之前的研究一致。研究表明，循环中性粒细胞的特性在IS后显著增加，并且中性粒细胞的改变与IS的严重程度显著相关。中性粒细胞与淋巴细胞比值升高可能预示着 IS 预后不良。然而，作为最早被募集到缺血性大脑中的免疫细胞之一，中性粒细胞在 IS 的病理学中起着双刃剑的作用。此外，FGF9的表达与中性粒细胞水平呈显著负相关，且呈Pearson相关系数，提示FGF9对缺血性脑卒中具有重要作用。
有趣的是，最近的某些研究表明FGF9在IS中的潜在作用。据报道，长链非编码 RNA SNHG7 可介导 FGF9 的上调，从而缓解缺氧和葡萄糖诱导的神经元细胞损伤。miR-339 介导的 FGF9 下调可促进缺氧诱导的神经元凋亡并损害细胞活力。这些结果表明，FGF9似乎是诊断和治疗IS的一个有希望的靶点。多项研究报道了 has-miR-767-5p 与癌症的参与。Feng 等人报道，has-miR-767-5p 的过表达会促进多发性骨髓瘤模型小鼠的肿瘤进展，并且这种效应可被 CircRNA circ_0000190 抑制。Meng 等人提出，LINC-PINT 下调 miR-767-5p 以诱导 TET2 表达，从而抑制甲状腺癌的侵袭性。然而，miR-767-5p在IS中的作用很少被报道。在此，我们确定了一种新的免疫相关circRNA-miRNA-mRNA调控网络。我们假设 circ_0127785/circ_0075008/miR-767-5p/FGF9 参与缺血性脑卒中的过程，并为 IS 的诊断和治疗带来了新的见解。然而，这些发现是基于生物信息学分析获得的。ceRNA网络中的调控关系仍在实验中得到证实。
结论
我们在IS中发现了一个潜在的circRNA-miRNA-mRNA调控网络，包括15个DEcircRNA、8个DEmiRNA和39个DEmRNA。此外，circ_0127785/circ_0075008/miR-767-5p/FGF9 被确定为 IS 的免疫相关调控子网络。我们的研究为circRNA介导的IS的病理过程提供了新的见解，目前的发现需要在未来进行验证。
