今天小编和大家分享一篇2024年11月发表在《Cancer Cell International》（IF:5.3）期刊上的文章《Expression of HECTD2 predicts peritoneal metastasis of gastric cancer and reconstructs immune microenvironment》。
背景：
胃癌发病率居全球第5位，死亡率居全球第3位，是最致命的消化系统恶性肿瘤之一。许多胃癌患者由于早期缺乏典型的临床表现而被诊断为晚期，且往往伴有多种类型的转移。其中，腹膜转移是晚期胃癌最具特征性的转移类型，预示着较差的预后，也是导致治疗失败的主要原因之一。胃癌腹膜转移是指原发肿瘤细胞通过血流、淋巴结或种植等方式在腹膜生长。腹膜转移患者疗效差、病情进展快、生存时间短，5年生存率不足2%。然而，目前胃癌腹膜转移的机制尚未阐明，有效的治疗策略仍缺乏。因此，有必要进一步探索胃癌腹膜转移诊断和预后预测的潜在生物标志物。
HECTD2是人类与E6AP C-端同源（HECT）的E3泛素连接酶之一，它通过作用于不同的底物在细胞中发挥多种生物学功能。HECTD2已被确定为神经母细胞瘤的候选驱动基因，在黑色素瘤中也能促进肿瘤细胞增殖和免疫逃逸。在 RCC中，作为HIF-1α的下游，它加剧了肾细胞癌的恶性进展。然而，在前列腺癌中，它是miR-221的潜在靶点，可促进前列腺癌细胞系的雄激素依赖性生长。因此，HECTD2在这类癌症中具有抗增殖作用，在结直肠癌中也有类似的结论。最新研究表明，人肠道微生物衍生的丙酸通过上调HECTD2来协调蛋白酶体的降解，从而靶向癌症中的EHMT2。这些结果表明，HECTD2在不同肿瘤中可能有不同的作用，其作用机制尚不清楚。
方法：
1，共表达网络分析、模块-特征相关性分析和模块功能富集分析
2，确定腹膜转移的重要候选标志物
3，HECTD2在腹膜转移的胃癌患者中高表达，高表达患者预后较差
4，HECTD2参与胃癌转移
5，HECTD2重塑肿瘤微环境与免疫疗法的疗效有关
研究结果：
（一）共表达网络分析、模块-特征相关性分析和模块功能富集分析
在本研究中，使用R包WGCNA中的WGCNA算法构建了共表达网络。在选择合适的软阈值功率后，网络的近似无标度拓扑分布为3。因此，最终选择了功率值3来进行后续分析。为了识别模块，使用“average”算法对拓扑重叠进行分层聚类，并使用动态树切割进行模块识别。最后，共鉴定出16个模块。
患者特征与模块特征之间的相关性分析发现yellow、pink、salmon、magenta和brown与腹膜转移呈显著正相关。因此，使用这些分离参数来定义腹膜转移。此外，red、light cyan、magenta、black和midnight blue模块与腹膜转移呈负相关。为了找出与腹膜转移最密切相关的基因，最终选择了与GC腹膜转移特征最密切相关的黄色模块。黄色模块中有434个基因。对434个基因进行了基因本体（GO）富集分析，结果显示生物粘附、细胞粘附和细胞表面受体相关信号转导是富集最显著的通路（图1A-C）。KEGG通路的富集分析表明，肌动蛋白细胞骨架调控、局灶粘附和Wnt信号通路与腹膜转移显著相关（图1D）。这些结果表明，黄色模块中的基因与肿瘤发生显著相关。
（二）确定腹膜转移的重要候选标志物
为了筛选出腹膜转移的关键候选标记物，进一步构建了一个包含434个节点和936条边的PPI信息网络（图1E）。将前50个枢纽基因输入Cytoscape软件进行相互作用网络绘制，并进一步选择构建中心网络（图1F）。为了从枢纽基因中探索腹膜转移的关键候选标志物，进一步根据MCODE评分从3个聚类中选择了最重要的子模块（红色模块）（图1G），最终在顶层网络中确定了核心基因HECTD2。
（三）HECTD2在腹膜转移的胃癌患者中高表达，高表达患者预后较差
通过初步筛选，聚焦于核心基因HECTD2。首先，应用GSE62254数据检测了胃癌腹膜转移与否患者中HECTD2基因表达的差异。结果显示，胃癌腹膜转移患者的HECTD2表达量明显更高（图2A）。此外，与GSE62254数据集中的低表达组相比，HECTD2高表达组胃癌患者的OS和PFS（图2B）均较差。然后，根据肿瘤组织中HECTD2的表达绘制了接收者操作特征曲线（ROC）。从图2C可以看出，ROC曲线下面积（AUC）值为0.762（95%CI：0.682-0.873, P < 0.001），这表明HECTD2具有良好的预后价值。最后，Kaplan-Meier生存分析显示了HECTD2的表达与胃癌患者的OS、PFS、DSS和DFS之间的关系。结果显示，HECTD2高表达胃癌患者的OS和DSS均比低表达胃癌患者差（图2D）。同时，PFS和DFS也显示出胃癌高表达患者获益较少的趋势（图2D）。进一步对HECTD2的表达、年龄、TNM分期和腹膜转移进行了单变量和多变量Cox分析。结果显示，在单变量分析中，除腹膜转移外，HECTD2的预后影响指数最高（HR = 4.237）（图2E）。然而，在多变量分析中，虽然HECTD2保持了影响指数优势，但在统计学上似乎较弱（P = 0.058）（图2F）。基于这一结果，建立了一个列线图，校准图显示列线图与理想模型相比具有相似的性能（图2G）。该列线图结合了与临床相关的病理参数，为临床医生预测胃癌患者1年、3年和5年OS的概率提供了定量方法（图2H）。每位患者都会得到每个预后参数的得分。总分越高，患者的预后越差。
接下来，检测了 26 组胃癌和邻近标本中 HECTD2 蛋白的表达水平。IHC结果显示，HECTD2在胃癌中的表达明显高于邻近标本（图2I）。此外，我们还下载了TCGA-STAD数据集，验证了HECTD2在胃癌中的表达明显高于邻近标本。同时，HECTD2的高表达导致胃癌患者的PFS和OS缩短。
（四）HECTD2参与胃癌转移
接下来，探讨了HECTD2在胃癌中的作用方式，并利用LinkedOmics在线数据库探索HECTD2的潜在机制。首先，选择了胃癌数据集，构建了HECTD2的共表达网络，并利用热图显示了与HECTD2正相关或负相关的前50个基因（图3A, B）。接着，通过基因组富集分析（GSEA）确定了HECTD2共表达基因的GO生物过程类别。结果显示，HECTD2及其共表达基因主要参与了“通过浆膜粘附分子的细胞-细胞粘附”（图3C）。然后，进行了京都基因组百科全书（KEGG）通路分析，结果显示共表达基因涉及“细胞粘附分子”和“病灶粘附”（图3D）。这些结果表明，HECTD2可能通过调控肿瘤细胞的粘附和间质重塑来促进癌症的进展。
此外，从cBioPortal（http://www.cbioportal.org/）在线数据集下载了TCGA胃癌数据集以及与HECTD2呈正相关的基因，筛选出相关系数大于0.3的基因，并利用Metascape（http://metascape.org/）进行了通路富集分析。结果显示，富集的通路还集中在“细胞连接组织”“细胞-细胞粘附”（图3E）。基于以上结果，推测HECTD2主要参与了胃癌的转移过程。因此，进一步分析了HECTD2在胃癌不同亚型和不同通路中的表达情况，发现HECTD2基因在MSI亚型胃癌中的表达量最低（图4A）。通路富集结果显示，HECTD2高表达患者的EMT和PI3K/AKT通路被显著激活（图4D、E），而细胞周期和细胞凋亡在高表达患者中被抑制，说明肿瘤细胞凋亡通路（图4B、C）在高表达患者中被抑制，正常细胞凋亡被抑制。
（五）HECTD2重塑肿瘤微环境与免疫疗法的疗效有关
由于发现HECTD2可能通过肿瘤间质重塑在促进肿瘤进展方面发挥作用，因此评估了不同HECTD2表达水平下的基质评分（肿瘤组织中的基质）、免疫评分（肿瘤组织中的免疫细胞浸润）和估计评分（肿瘤纯度）。结果显示，在高表达HECTD2的胃癌患者中，这三个评分都明显较高（图5A）。这表明，高表达患者的间质细胞和免疫细胞浸润均增加，这可能是导致预后不良的因素。同时，这也与之前的研究结论一致：即HECTD2的高表达通过重建肿瘤基质和肿瘤微环境发挥作用。
接下来，评估了HECTD2对免疫细胞浸润的影响。如图5B所示，HECTD2的高表达可能会招募更多的“静息肥大细胞”、“单核细胞”和“CD4记忆静息T细胞”，但会拒绝“巨噬细胞M0”、“T细胞”、“CD4记忆激活”和“肥大细胞激活”细胞的浸润。针对这一现象，进一步评估了HECTD2与免疫疗法疗效的关系。首先，检测了目前被认为与免疫治疗疗效相关的肿瘤突变负荷（TMB），发现它与HECTD2的表达呈负相关（图5C），这表明HECTD2低表达的患者可能对免疫检查点抑制剂的治疗反应更好。然后计算了免疫评分，发现低表达组的免疫评分高于高表达组（图5D-G），这也证实了免疫检查点抑制剂在低表达组的疗效可能更好，为药物的临床应用提供了依据。
基于HECTD2与巨噬细胞浸润存在明显的正相关和负相关，应用多重免疫荧光检测法研究了胃癌标本中HECTD2表达与M1、M2巨噬细胞浸润的相关性（图6A）。图6B显示了相应切片的IHC图像。结果显示，HECTD2的高表达明显诱导了M2巨噬细胞的浸润。统计分析显示，HECTD2与M2巨噬细胞表达呈正相关（r = 0.466，p = 0.022，图6C），但与M1巨噬细胞呈负相关（r = -0.313，p = 0.136）。统计分析显示，HECTD2高表达的胃癌患者预后较差（图6D），这与之前的在线数据分析结果一致。在腹膜转移的胃癌患者中，HECTD2的表达更高（图6E），进一步证实了HECTD2是胃癌腹膜转移的有效预测指标。
同时，研究了HECTD2的表达与临床病理参数的关系，发现HECTD2的表达与T分期和N分期显著相关。此外，还分析了包括HECTD2表达在内的各种病理参数与胃癌预后的相关性。结果显示，TNM分期、血管侵犯和HECTD2的高表达是胃癌的不良预后因素。基于这一结果，分析了预测免疫治疗疗效的相关指标，发现ECOG评分、M1、M2细胞浸润和HECTD2表达均是免疫治疗疗效的有效指标。从HR值来看，HECTD2表达可能更有优势，而PD-L1表达和CEA水平也是预测疗效的指标，但没有明显的统计学意义，这可能是由于我们选择的PD-L1表达截断值和样本量有限所致。HECTD2高表达的患者治疗反应较差，而PR疗效好的患者HECTD2表达较低（图6F），mRNA水平相似（图6G）。这表明HECTD2不仅会促进胃癌的进展和腹膜转移，还是胃癌的独立预后因素和免疫治疗疗效的预测因素。
