今天小编和大家分享一篇2024年9月12日发表在Heliyon.期刊的文章《Identification of diagnostic markers and molecular clusters of cuproptosis-related genes in alcohol-related liver disease based on machine learning and experimental validation》。PMID: 39315155
酒精性肝病（Alcohol-related liver disease，ALD）是由长期大量饮酒引起的肝脏损伤，涵盖了一系列疾病，如酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化及肝硬化的并发症。在全球范围内，ALD是慢性肝病的主要病因之一，占美国肝硬化相关死亡的48%。在中国，ALD的发病率与美国相当，正成为导致中国肝病总体负担加重的重要因素。铜是一种细胞外元素，对骨髓和中枢神经系统的正常功能至关重要，并且是多种抗氧化酶（如超氧化物歧化酶）的辅助因子，因此铜代谢紊乱可能导致器官功能障碍。
关于揭示铜死亡与ALD潜在病理生理机制之间关系的研究相对较少。在该研究中，从GEO下载与ALD相关的数据，并进行机器学习等分析，以探索铜死亡相关基因（Cuproptosis-related genes，CRGs）与ALD之间的关系。
背景
ALD是由长期大量饮酒引起的肝脏损伤，涵盖了一系列疾病，如酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化及肝硬化的并发症。在全球范围内，ALD是慢性肝病的主要病因之一，占美国肝硬化相关死亡的48%。在中国，ALD的发病率与美国相当，正成为导致中国肝病总体负担加重的重要因素。
铜是一种细胞外元素，对骨髓和中枢神经系统的正常功能至关重要，并且是多种抗氧化酶（如超氧化物歧化酶）的辅助因子，因此铜代谢紊乱可能导致器官功能障碍。铜调节失常与肝病密切相关。肝豆状核变性是铜过载的一个经典例子，这是一种由ATP7B基因多种突变引起的常染色体隐性遗传病。研究表明，ALD患者存在铜代谢紊乱。酒精饮食可导致肝脏损伤，并降低HIF-1α、封闭蛋白、SOD1和GPX1基因的表达。研究还显示，饮食中缺铜可能加剧这些变化，而补铜则可能改善这些状况。此外，体外细胞实验表明，适当的铜补充可以促进细胞生长，减少活性氧（ROS）的产生。铜死亡是一种与多种疾病相关的新型细胞死亡方式，如非酒精性肝病、肝豆状核变性和肝细胞癌。
关于揭示铜死亡与ALD潜在病理生理机制之间关系的研究相对较少。因此，我们仍需要对ALD中CRGs的表达、诊断、免疫相关性及机制进行综合研究。在本研究中，从基因表达综合数据库（GEO）下载了与ALD相关的数据，并进行了机器学习等分析，以探索CRGs与ALD之间的关系。该研究鉴定了差异表达基因及其中的关键基因，随后构建了预测模型并进行了外部验证。最后，进行免疫浸润分析，评估相关药物。
方法
1.识别ALD中的CRGs；
2.ALD诊断标志物基因的鉴定；
3.评估ALD诊断标志物基因的诊断性能；
4.GSEA、GSVA及ssGSEA分析；
5.CRG聚类与免疫微环境之间的关联性探究；
6.CRG聚类、基因聚类与CRG评分之间的相关性探究；
7.CRG聚类、基因聚类与CRG评分之间的相关性探究；
8.基于标志基因的候选药物识别及ceRNA网络构建
9.小鼠ALD模型及细胞酒精干预模型中CRGs的表达情况。
结果
（一）识别ALD中的CRGs
使用包含28个ALD样本和7个对照样本（GSE28619和GSE103580）的两个批次标准化数据集，通过‘limma’包共鉴定出6234个差异表达基因（DEGs，p < 0.05）。DEGs的热图如图2A所示。DEGs的火山图如图S1所示，6234个DEGs的GO分析如图S2所示，KEGG分析如图S3所示。
此外，在6234个差异表达基因（DEGs）中，有38个与CRGs重叠，揭示出18个在ALD组和对照组之间存在显著差异的差异表达铜死亡相关基因（DE-CRGs），包括DLAT、ISCA2、GLRX5、NDUFV2、ACO2、NDUFA1、DPYD、DBT、LIPT1、NFE2L2、GLS、PDHB、PPAT、PLAT、CDKN2A、SLC31A1、NDUFA8和LIPA，如图2B所示。这18个DE-CRGs的染色体位置以圆形图展示（图2C）。在ALD中，有12个DE-CRGs（ISCA2、NDUFV2、ACO2、NDUFA1、LIPT1、GLS、PDHB、PPAT、PLAT、CDKN2A、NDUFA8和LIPA）上调，而6个（DLAT、GLRX5、DPYD、DBT、NFE2L2和SLC31A1）下调（图2D和E）。
使用STRING进行了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，以探索这18个DE-CRGs之间潜在的相互作用，如图2F所示。这18个DE-CRGs之间的相关性如图2G所示。通过基因本体富集分析，包括生物过程、细胞组分和分子功能的跨基因富集，发现DE-CRGs与有氧呼吸、嘌呤核糖核苷酸生物合成、氧化还原酶和铁硫簇结合等通路相关。结果如图2H所示。此外，KEGG通路分析中的脂酸代谢、柠檬酸循环等通路如图2I所示。
（二）ALD诊断标志物基因的鉴定
鉴于ALD患者和健康对照者之间的个体差异性和异质性，从18个DE-CRGs中，利用LASSO和两个经过验证的机器学习模型（支持向量机递归特征消除SVM-RFE和随机森林RF）来鉴定候选的DE-CRGs，这些基因有助于预测ALD的诊断。LASSO鉴定出了8个基因（Fig. 3A和B）。SVM的特征数量为8（Fig. 3C）。分类器的最小误差为0.0，最大准确率为1.0（Fig. 3D）。对18个DE-CRGs进行了随机森林分析，其中3个基因的平均基尼减少量大于2（Fig. 3E和F）。然后，使用韦恩图来找出LASSO、SVM-RFE和随机森林分析中共同的关键基因。最终，确定了三个关键基因（DPYD、SLC31A1和DBT）（Fig. 3G）。
（三）评估ALD诊断标志物基因的诊断性能
为了评估DPYD、SLC31A1和DBT三个核心基因的预测效率，使用“rms”包构建ALD患者的列线图模型（Fig. 4A）。该列线图模型利用每个生物标志物的数值来预测ALD风险，校正曲线显示了预测概率与实际概率之间存在显著关联（Fig. 4B）。决策曲线分析（DCA）显示，该模型的净收益显著高于0，表明其具有很高的准确性，并能为医生提供决策依据（Fig. 4C）。临床影响曲线显示，该列线图模型具有很高的诊断能力（Fig. 4D）。ROC曲线分析显示，这三个标志物基因特征组合在诊断ALD时表现出高性能（AUC = 0.704，Fig. 4E）。这三个基因的单独预测ROC结果均超过0.83（Fig. 4F），且它们在两个数据集中的表达均降低（Fig. 4G和J）。在GSE142530和GSE155907数据集中，这三个基因组合的ROC曲线分别为0.670和0.800（Fig. 4H和K），同时展示这三个基因分别预测性能的ROC曲线（Fig. 4I和L）。这些结果表明，基于这三个标志物基因的模型可能对ALD具有强大的预测效力。
（四）GSEA、GSVA及ssGSEA分析
借助ssGSEA方法，对前述模型中涉及的三个基因的主要信号通路进行了识别。通过KEGG通路的GSEA分析，发现这三个基因与甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸及视黄醇的代谢过程密切相关（图5A–C）。具体而言，DPYD与SLC31A1基因均参与到细胞色素P450的代谢活动中（图5B和C）；而DBT与SLC31A1则与激素的生物合成有所联系（图5A和C）。此外，DPYD还涉及色氨酸的代谢，并展现出细胞色素P450对基因组层面的影响（图5B）。补充材料中的图S4至S6则详细展示了GO富集分析的GSEA结果。
GSVA分析揭示了基于这三个核心基因（DBT、DPYD、SLC31A1）表达水平划分的低表达与高表达亚型间存在着截然不同的活性通路。研究结果显示，DBT、DPYD及SLC31A1的过表达均与细胞外基质-受体相互作用紧密相关（图5D至F）。此外，DBT与SLC31A1的过表达还涉及到利什曼原虫感染、糖苷生物合成及病毒性心肌炎等生物学过程。值得注意的是，在高DPYD表达组中，半乳糖代谢及球型糖基生物合成通路呈现出活跃状态（图5E）。相反，DBT、DPYD及SLC31A1的低表达则与赖氨酸降解、色氨酸代谢、视黄醇代谢、苏氨酸代谢以及类固醇激素生物合成等一系列通路相关联（图5D至F）。GO富集分析的GSVA结果详见补充材料图S7至S9。
为了深入探究铜死亡是否通过调控免疫浸润来加速酒精性肝病（ALD）的进展，我们进一步开展了ssGSEA分析。分析结果显示，与正常肝组织相比，ALD患者的B细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、辅助性T细胞及Th1细胞的数量均显著降低（图5G）。在免疫功能层面，ALD组的抗原呈递细胞（APC）共抑制功能、细胞溶解活性以及II型干扰素（IFN）反应评分均低于对照组（图5H）。特别地，图5F揭示了DPYD与II型IFN反应、Th1细胞及NK细胞之间存在显著关联；DBT则与MHC I类分子、CCR及树突状细胞（aDCs）密切相关。而SLC31A1则与B细胞、APC共抑制功能及CCR呈现出显著相关性（图5I）。
（五）CRG聚类与免疫微环境之间的关联性探究
采用R语言中的“ConsensusClusterPlus”软件包，基于三个关键的基因调节因子，对CRG聚类进行了细致的分类。在选定最优k值为2的条件下，成功地将28份ALD样本划分为了CRG聚类A与B两大类别（图6A至C）。对比结果显示，CRG聚类A中的DBT、DPYD及SLC31A1基因表达水平显著高于CRG聚类B（图6D）。同时，还利用热图直观地展示了两个CRG聚类间独特的基因表达特征（图6E）。此外，采用主成分分析（PCA）进一步验证了CRG聚类分类的合理性与准确性（图6F）。
鉴于ALD与免疫微环境之间的潜在联系，深入剖析了免疫细胞的浸润模式。如图6G所示，CRG聚类A与B之间存在显著的免疫细胞类型差异，这提示了两个聚类在免疫反应方面的不同。同时，还借助ssGSEA方法生成的热图，进一步验证了免疫细胞浸润与三个CRG调节因子表达谱之间的密切联系（图6H）。为进一步探索免疫细胞浸润与CRG之间的关系，我们同样采用了ssGSEA方法进行分析。分析结果显示，DPYD基因的表达水平与活化树突状细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤细胞及单核细胞的数量呈负相关（图6I）。而SLC31A1基因则与未成熟树突状细胞的数量呈负相关，但与单核细胞的数量呈正相关（图6J）。另外，DBT基因的表达水平与多种免疫细胞，包括活化CD4 T细胞、树突状细胞、γδT细胞、未成熟树突状细胞、髓系来源抑制性细胞（MDSCs）、巨噬细胞、肥大细胞、浆细胞样树突状细胞、调节性T细胞、滤泡辅助性T细胞及Th1细胞的数量均呈负相关（图6K）。
（六）CRG聚类、基因聚类与CRG评分之间的相关性探究
在图7A中，展示基因聚类A与B之间共有的92个DEGs。为了与基因聚类的数量保持一致，将基因聚类的最优k值确定为2，如图7B至D所示。接着，我们利用热图揭示了这两个基因聚类间CRGs表达谱的差异（图7E）。具体而言，与基因聚类A相比，基因聚类B中的DBT、DPYD和SLC31A1基因表达水平呈现出上升趋势（图7F）。进一步分析发现，基因聚类A中六类免疫细胞的数量显著高于基因聚类B（图7G），这凸显了免疫微环境浸润的一个关键特征。为了直观比较CRGs聚类与基因聚类间的CRGs评分差异，采用了箱线图进行展示。结果显示，CRGs聚类A的CRGs评分低于CRGs聚类B（图7H），基因聚类A的CRGs评分也低于基因聚类B（图7I）。这些发现表明，不同CRGs聚类与基因聚类间的CRGs评分存在显著差异。为了更深入地理解CRGs评分、CRGs聚类与基因聚类之间的关系，利用R语言的“ggalluvial”软件包构建了桑基图（图7J）。
（七）基于标志基因的候选药物识别及ceRNA网络构建
图8 A-B
为了深入探究ALD的药物治疗方案，借助DGIdb数据库分析关键基因与药物间的相互作用。通过Cytoscape软件的分析，清晰地展示了遗传标志物与药物之间的相互作用关系（图8A）。此外，利用TargetScan、miRanda和miRDB数据库，围绕这三个核心基因构建了ceRNA网络，该网络涵盖了170个microRNA（miRNA）和138个长链非编码RNA（lncRNA）（图8B）。
（八）小鼠ALD模型及细胞酒精干预模型中CRGs的表达情况
图9A-H
HE染色和苏丹红O染色结果显示，ALD组小鼠肝脏出现脂肪变性（图9A）。同时，ALD组小鼠的谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平显著高于对照组（图9B）。上述结果表明，成功构建ALD模型。通过qRT-PCR测定mRNA水平，与对照组相比，ALD组中三个关键基因的表达水平有所降低（图9C）。此外，通过Western blot分析，这三个基因在ALD肝脏组织和正常肝脏组织中的蛋白表达量存在显著差异（图9D-E）。尼罗红染色结果显示，乙醇组细胞内存在大量脂质沉积，表现为脂肪滴数量明显增多（图9F）。综上所述，这些结果共同表明已成功建立细胞酒精干预模型。同时，也使用qRT-PCR检测了三个CRGs核心基因的mRNA水平，结果显示与生理盐水组相比，乙醇组中DPYD、DBT的表达显著下调（图9G）。免疫印迹分析也证实了乙醇组中这些基因表达量相似的下降趋势（图9H）。这些结果表明，这三个特征性的CRGs可能在ALD的发生发展过程中发挥着重要的调控作用。
