UBE2S和UBE2C：一种新的乳腺癌预后生物标志- 大数跨境

中科生信

2023-02-17

导读：哈喽，大家早上好！今天小编和大家分享一篇23年2月发表在Frontiers in Immunology杂志（

哈喽，大家早上好！今天小编和大家分享一篇23年2月发表在Frontiers in Immunology杂志（IF: 8.786）的文章《UBE2S and UBE2C confer a poor prognosis to breast cancer via downregulation of Numb》。乳腺癌（breast cancer）是全球最常见的恶性肿瘤，也是癌症死亡的主要原因。其中，雌激素受体（ER）阳性(ER+)乳腺癌是最常见的乳腺癌分子亚型。据报道，在乳腺癌中，抑制泛素结合酶E2S (UBE2S)和E2C (UBE2C)能够抑制乳腺癌细胞的恶性特征。Numb在许多癌症中被认为是肿瘤抑制因子，也参与泛素化和蛋白酶体降解。在这篇文章中，作者采用生物信息学分析来确定乳腺癌以及ER+乳腺癌中UBE2S、UBE2C和Numb的表达和预后的相关性，阐明了潜在的调节机制，并促进了新的治疗策略的发展。

背景和材料

乳腺癌（breast cancer）是2020年威胁全球妇女生命的所有新诊断中最普遍的癌症。雌激素受体（ER）阳性(ER+)乳腺癌是最常见的乳腺癌分子亚型，探索ER+和ER-阴性乳腺癌之间的差异表达基因可能有助于了解乳腺癌的发病机制和开发新的乳腺癌治疗药物靶点。泛素化-蛋白酶体途径是蛋白质降解系统的翻译后修饰，这个过程由E1、E2和E3酶介导。泛素结合酶E2S (UBE2S)和E2C (UBE2C)是E2家族的重要成员，据报道在许多癌症的发生和发展中起致癌作用。在乳腺癌中，抑制UBE2S或UBE2C能够抑制乳腺癌细胞的恶性特征，并使癌细胞对辐射或药物敏感以增强临床疗效。然而，UBE2S和UBE2C在乳腺癌中的预后作用以及共同调节机制仍有待阐明。据报道，Numb在许多癌症中被广泛认为是细胞命运决定因子和肿瘤抑制因子，其调节肿瘤抑制因子，如p53和PTEN，并通过泛素化促进GLI1癌基因降解。E3泛素连接酶LNX1和LNX2是Numb蛋白X1和X2的配体，能够与Numb相互作用并促进其降解。此外，低Numb表达促进了前列腺癌。然而，UBE2S/UBE2C和Numb之间的相互作用以及它们在乳腺癌(BC)临床结果中的作用还没有被广泛阐明。因此，探索乳腺癌以及ER+乳腺癌中UBE2S、UBE2C和Numb的表达和预后价值有助于识别潜在的诊断和预后生物标志物和治疗靶点。

方法

1.数据来源：

（1）从cBioPortal (cBio Cancer Genomics Portal)数据库(https://www.cbioportal.org/)下载乳腺癌转录组数据TCGA-BC。通过Pearson相关性分析探索UBE2S、UBE2C和Numb的相关性。

（2）使用Oncomine数据库（www.oncomine.org）分析各种主要乳腺癌亚型及其各自正常对照中UBE2S、UBE2C和Numb的表达差异。

（3）通过CCLE public project(https://portals . broadinstitute . org/ccle)分析主要癌细胞系(包括乳腺癌)中的UBE2S、UBE2C和Numb的拷贝数。

（4）从人类蛋白质图谱数据库（Human Protein Atlas database，HPA）（www.proteinatlas.org）获得乳腺癌组织中的UBE2S、UBE2C和Numb免疫组织化学染色的代表性图像，评估乳腺癌组织中的UBE2S、UBE2C和Numb的蛋白表达水平。

2. Kaplan-Meier（K-M）生存分析。通过K-M生存分析评估乳腺癌和ER+亚型患者的预后与UBE2S、UBE2C和Numb表达之间的相关性。

3. 细胞培养。所有细胞系均获自the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)，包括一种正常乳腺上皮细胞系(MCF10A)、三种ER乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3)和两种ER+乳腺癌细胞系(MCF7和T47D)。

4. 实时定量RT-PCR。通过实时定量RT-PCR在细胞水平检测UBE2S、UBE2C和Numb的mRNA表达水平。

5. Western blot检测UBE2S、UBE2C和Numb的蛋白表达水平。

6. 瞬时过表达和敲除。对于瞬时过表达，用构建的过表达UBE2S/UBE2C的质粒(pcDNA3.1，Thermo Fisher Scientific)或使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen)的阴性对照转染细胞。对于瞬时敲除，用靶向UBE2S/UBE2C或阴性对照的小干扰RNA(siRNAs)转染细胞

7. 菌落形成试验。将MCF7和MDA-MB-231细胞以每孔1000个细胞的浓度接种在6孔板中，培养10-14天。将菌落固定并用0.2%结晶紫染色。

8. CCK-8细胞增殖试验检测细胞增殖情况。

结果

1.在乳腺癌中，UBE2S和UBE2C的表达上调，而Numb的表达下调（图1-3）

通过Oncomine数据库评估UBE2S、UBE2C和Numb在不同肿瘤中的mRNA表达水平。与正常对照相比，UBE2S和UBE2C的表达通常较高，而Numb的表达较低，特别是在乳腺癌中（图1和图2A）。并且，UBE2S和UBE2C的表达随着乳腺癌组织学分级和病理阶段等级的升高而增加，而Numb的表达相反(图2B-C)。在9个独立分析中发现，乳腺癌中UBE2S和UBE2C显著升高，而Numb显著降低(图3A)。此外基于人类蛋白质图谱(HPA)数据库发现UBE2S和UBE2C表达高的乳腺癌组织中，Numb蛋白的表达低(图3B)，而UBE2S和UBE2C表达低的乳腺癌组织中，Numb蛋白的表达高(图3B)。总之，这些结果与表明了乳腺癌中UBE2S和UBE2C的致癌作用和Numb的肿瘤抑制作用。

2.与ER− 乳腺癌相比，ER+乳腺癌中UBE2S和UBE2C的表达下调，而Numb的表达上调。

基于Oncomine数据库发现，与ER+乳腺癌相比，在ER-乳腺癌中，UBE2S和UBE2C的mRNA水平较高，而Numb则降低。通过对正常乳腺上皮细胞系(MCF10A)、ER-乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3)和ER+乳腺癌细胞系(MCF7和T47D)进行qRT-PCR和western blot检验发现，与MCF10A相比，乳腺癌细胞系中的UBE2S和UBE2C增加，Numb表达减少（图4A)。与ER+乳腺癌细胞系相比，ER-细胞表现出较高的UBE2S和UBE2C表达以及较低的Numb表达（图4B-C)。总之，UBE2S/UBE2C和Numb之间的调节在ER+乳腺癌中起着关键的作用。

3.在乳腺癌患者和ER+患者中，UBE2S和UBE2C高表达的患者预后更差，而Numb则相反（图5-8）

基于Oncomine数据库，通过K-M生存分析探索UBE2S、UBE2C和Numb的预后价值。寿命较长的乳腺癌患者的UBE2S和UBE2C的mRNA水平显著低于寿命较短的患者，而Numb的mRNA水平则相反（图5A-C)。也就是说，在乳腺癌患者中，高水平的UBE2S和UBE2C以及减少的Numb表达与较短的寿命有关。接下来，分别基于UBE2S、UBE2C和Numb的mRNA表达水平将患者分为高低表达组，并比较高低表达组患者的生存差异。结果显示，在乳腺癌患者和ER+乳腺癌患者中，均发现UBE2S高表达、UBE2C高表达、Numb低表达组的患者预后均更差（图6-7）。为了进一步阐明UBE2S/UBE2C与Numb在乳腺癌预后中的负相关性，将乳腺癌患者分为三组：第一组具有较高的UBE2S或UBE2C和较低的Numb表达(UBE2S or UBE2C high + Numb low)，第2组具有较低的UBE2S或UBE2C和较高的Numb表达(UBE2S or UBE2C low + Numb high)，其余的被归类为第三组（other）。结果显示，第一组患者的总体生存期（overall survival，OS）和无复发生存率（relapse-free survival ，RFS）明显短于其他两组（图8）。总的来说，在乳腺癌患者和ER+患者中，UBE2S和UBE2C高表达的患者预后更差，而Numb则相反。

4.在乳腺癌中UBE2S和UBE2C均抑制Numb的表达并促进肿瘤恶化（图9A）

此外，基于TCGA-BC数据集探索了Numb和UBE2S/UBE2C之间的相关性，发现Numb与UBE2S高度负相关(Spearman相关性系数= 0.52，Pearson相关相关性系数= 0.51)，Numb和UBE2C中度负相关(Spearman相关性系数= 0.34，Pearson相关性系数= 0.33）（图9A）。进一步地，在ER+细胞系MCF7和ER-细胞系MDA-MB-231中验证UBE2S和UBE2C对Numb的负调节。其中，ER+细胞系MCF7有较高的Numb表达和较低水平的UBE2S和UBE2C表达，在MCF7中过表达UBE2S或UBE2C后，Numb的蛋白表达水平降低。ER-细胞系MDA-MB-231具有较高水平的UBE2S和UBE2C表达和较低的Numb表达，敲降细胞UBE2S或UBE2C后，发现Numb的蛋白表达水平显著增加（图9B-C）。此外，通过集落形成和CCK8细胞增殖实验评估了肿瘤细胞的恶性程度，结果显示UBE2S或UBE2C过表达的MCF7细胞表现出更强的集落形成和增殖能力，而UBE2S或UBE2C敲低的MDA-MB-231细胞表现出比对照明显更低的恶性度(图9D-E)。总之，UBE2S和UBE2C都抑制Numb的表达，并促进乳腺肿瘤的恶性程度。