早！今天小编和大家分析一篇2022年7月发表在《J Transl Med》（IF:5.531）期刊上的文章《Bladder cancer-derived exosomal KRT6B promotes invasion and metastasis by inducing EMT and regulating the immune microenvironment》。在本次研究中，基于TCGA和GEO数据库的基因表达谱和临床信息分析了外泌体mRNA和蛋白质的表达模式以及匹配的临床病理学特征。此外，我们进行了一系列实验来进行验证。该思路同样适用于其他肿瘤的研究，有相关需求的老师欢迎联系我们。
背景：
膀胱癌(bladder cancer, BLCA)是全球最常诊断出的癌症之一。其作为泌尿系统最常见的恶性肿瘤，目前尚无有效的诊断方法。因此，迫切需要寻找其他有效的生物标志物来辅助BLCA的诊断。外泌体是30–150 nm的细胞外载体，具有多种生物学功能，存在于各种生物体液中。先前的研究表明，外泌体参与细胞间通讯并影响许多肿瘤的周围微环境。此外，肿瘤来源的外泌体（TDE）是许多肿瘤过程中的重要调节因子，包括肿瘤侵袭、转移和耐药性。然而，关于它们在BLCA中的作用知之甚少。因此，我们认为有必要进一步探讨TDEs参与BLCA发生发展的机制。以期寻找可被用作BLCA的预后标志物和抗癌治疗的靶点。
方法：
1，TCGA和 GEO公共数据库获取BLCA数据；ExoCarta 数据库获得BLCA衍生的外泌体中的mRNA和蛋白质；
2，利用R“limma”包筛选差异基因；
3，通过TIMER 2.0数据库分析KRT6B在各种肿瘤中的表达。通过HPA数据库分析正常组织和肿瘤组织中KRT6B的差异表达，结合临床因素对KRT6B进行了单变量和多变量 Cox 回归分析；
4，使用GSEA软件在KRT6B高表达和低表达组中进行基因集富集分析（GSEA）；
5，通过“CIBERSORT”算法进行免疫浸润分析；
6，通过Pearson相关分析评估以确定目标基因表达与药物敏感性之间的相关性；
研究结果：
一、BLCA中的外泌体DEG及生存分析
在BLCA衍生的外泌体中鉴定出52个DEGs（图 1A-C）。为了确定与BLCA患者预后相关的关键基因，我们对前20个差异表达的外泌体基因进行了生存分析。结果显示，除KRT6B外，其余9个上调的DEGs与BLCA患者的生存期无统计学正相关（图2)。生存曲线表明，KRT6B的高表达与较短的总生存期(OS)相关，并预示着预后不良。
二、KRT6B在BLCA中的生物学作用分析
1.为了进一步了解KRT6B的生物学功能，首先在NCBI数据库中对KRT6B进行了查询（图3A）。此外，通过TIMER2.0网站分析了KRT6B在泛癌和匹配的正常组织中的差异表达。发现KRT6B在多种肿瘤中上调，包括BLCA、CESC、CHOL、COAD、ESCA、HNSC、KIRC、LUAD、LUSC、READ、SKCM、STAD、THCA 和UCEC（图 3B)。TCGA 和GEO数据集 (GSE166716)证实KRT6B在BLCA中的表达高于匹配的正常组织（图 3C）。此外，从HPA数据库检索到免疫组织化学(IHC)染色数据集，结果显示与正常膀胱组织相比，BLCA组织中的KRT6B显著增加（图 3D)。
2.根据KRT6B的表达水平，将来自TCGA 的临床数据分为高表达组和低表达组。为了探讨KRT6B表达与BLCA临床特征之间的关系，进行了单变量Cox回归分析和多变量Cox回归分析。结果表明，KRT6B的表达、年龄和分期是BLCA的独立预后危险因素（图 4A-B）。通过UALCAN网站发现KRT6B在具有不同组织学亚型、分子亚型、转移状态和BLCA个体癌症分期的患者中表达不同（图 4C）。与TCGA结果一致，GSE13507数据结果表明，上调的KRT6B表达与BLCA中的临床病理特征相关（图 4D)。这表明，KRT6B可能参与BLCA的进展，特别是从非侵袭性肿瘤向侵袭性肿瘤的转变。
3.为了阐明KRT6B在BLCA发展中的机制，基于来自TCGA数据库的BLCA样本的KRT6B高表达和KRT6B低表达组进行了GSEA。结果显示，KRT6B高表达组富集炎症反应通路，包括IL-6/JAK/STAT3信号通路和干扰素-γ（IFN-γ）反应通路（图5A）。EMT相关通路的激活与KRT6B的表达呈正相关（图5A）。此外，对EMTome 数据库的分析表明，KRT6B与转移密切相关（图5B）。
4.EMT是上皮细胞获得侵袭力的关键步骤，是BLCA细胞肌层侵袭转移的重要条件。目前，有几个基因已被证明是EMT过程的生物标志物，包括CDH1、CDH2、vimentin、MMP9、Twist、snail和TGF-β。通过TIMER2.0网站探索了KRT6B与这些生物标志物之间的相关性。结果显示KRT6B与这些关键基因之间存在显着相关性（图 6A）。此外，KRT6B与免疫反应基因显着正相关，例如CXCL9和CXCL10（图 6B).。上述结果证明，KRT6B参与了BLCA的EMT过程和免疫调节。
5.为了探索KRT6B在BLCA肿瘤微环境中的潜在作用，利用EMTome数据库和CIBERSORT算法分析BLCA 中免疫细胞浸润的情况（图 7A-B）。研究发现几种免疫细胞在KRT6B高表达组中具有显着更高的浸润密度，包括M2巨噬细胞等（图 7C）。热图显示了22种免疫浸润细胞与来自TCGA队列的肿瘤样本的相关性（图 7D)。
6.相关性分析显示，M2巨噬细胞的浸润水平与KRT6B的表达呈正相关（图 8A）。此外，K–M 生存分析表明，具有较高M2巨噬细胞浸润的患者生存较差（图 8B)。以上证据表明，KRT6B与免疫细胞的不同分布，尤其是BLCA中M2巨噬细胞的极化有一定关系。为了验证这一假设，分别分析了 M2 巨噬细胞及其关键标志物与KRT6B的相关性。结果表明，KRT6B的表达水平与M2巨噬细胞的浸润水平呈正相关（图 8C）。
7.研究发现多个检查点基因在BLCA中表现出差异表达（图 9A）。鉴于KRT6B与免疫力密切相关，进一步研究了KRT6B与免疫检查点基因（如 PD-L1）之间的相关性（图 9B-C）。结果表明，具有KRT6B高表达的BLCA患者可能从联合免疫检查点阻断(ICB)的治疗中获益更多。
三、BLCA中的KRT6B表达调节了EMT信号通路
为了进一步探索KRT6B在BLCA临床样本中的表达，对48对BLCA组织样本和匹配的相邻正常组织样本进行了qRT-PCR 和 WB。qRT-PCR 结果显示，KRT6B在BLCA组织样本中的表达高于邻近的正常组织样本（图 10A)。蛋白质水平和相应的mRNA水平显示相同的结果（图 1B）。此外，评估了KRT6B的表达与BLCA的临床病理特征之间的关系。结果显示，KRT6B的高表达与肿瘤侵袭性和BLCA的T分期呈正相关。其他特征，包括N分期、M分期和肿瘤分级，与KRT6B表达无显著相关性（图 10C)。此外，KRT6B的高表达显示与BLCA患者的较差OS相关（图 10D)。
为了进一步研究KRT6B的作用，通过qRT-PCR和WB验证了KRT6B在人尿道上皮永生化细胞系和BLCA细胞系中的表达（图 11A、B）。发现KRT6B在BLCA细胞系中的表达普遍高于人尿道上皮永生化细胞系。通过用siRNA特异性靶向KRT6B来敲低T24和BIU87细胞中的KRT6B。与对照组相比，KRT6BmRNA和蛋白水平显着下调（图 11C、D）。Transwell迁移测定和侵袭测定表明，KRT6B敲低抑制了T24和BIU87细胞的迁移和侵袭（图 11E)。此外，当KRT6B被敲低时，划痕闭合得更慢（图 11F)。
