大家早上好！今天小编和大家分享一篇5月11日发表在Journal of Translational Medicine（IF:7.552）杂志上的题目为《Gut microbiome combined with metabolomics reveals biomarkers and pathways in central precocious puberty》的文章。作者利用来自微生物和代谢物的多组学数据构建了一个分类器，用于将 CPP 患者与普通人群区分开来，并通过综合分析识别出 CPP 的潜在治疗分子标记。
背景：中枢性性早熟(central precocious puberty, CPP)是青春期前儿童的常见病，主要由内分泌系统紊乱引起。新出现的证据强调了肠道微生物参与激素分泌，但它们在 CPP 中的作用和下游代谢途径仍然未知。
方法：
（1）为了探索 CPP 中的肠道微生物和代谢改变，对 91 名 CPP 患者和 59 名健康对照者进行了 16S rRNA 测序和非靶向代谢组学分析。
（2）对 16S rRNA 基因序列和代谢谱进行了生物信息学和统计分析，包括比较 alpha 和 beta 多样性、微生物丰度。
（3）根据微生物和代谢物构建分类器。
（4）进行功能和途径富集分析以鉴定 CPP 中改变的微生物和代谢物。
结果：
1.肠道菌群有助于有效区分 CPP 患者和对照组
为了研究肠道微生物组的改变是否与 CPP 相关，对包含 91 名患者和 59 名健康对照的中国队列进行了 16s rRNA 基因测序。超过 10,000,000 个序列被注释到 SILVA rRNA 文库数据库中，随后的分析在操作分类单元 (OTU) 中进行。在这个队列中，在 97% 的相似性阈值条件下，总共识别出 2840 个 OTU。CPP 和健康对照组中的 OTU 数量相当，这可能是由于两组之间有大量共享微生物（图 1A -B）。尽管存在相当多的共享微生物，但组内 OTU 相关性高于组间（图 1C ）。Chao 指数作为 alpha 多样性的指标之一，在 CPP 组中表现出较低的水平（图 1D，p = 0.0021）。同时，使用 ANOSIM 结合PCoA 对 beta 多样性的分析也发现了组间的显着差异（图 1E ）。这些结果表明，肠道微生物群的组成可能在 CPP 发育过程中发生了变化。因此，我们比较了 CPP 和健康对照组之间的肠道微生物群丰度。我们发现在属水平的双歧杆菌、布劳氏杆菌和链球菌在CPP 组中表现出更高的丰度（图 1F -H）。由于组间肠道微生物群的差异物种不能很好地区分 CPP 患者和人群，我们使用随机森林模型和 boruta 算法为所有物种构建分类器。最终识别出24个代表性物种，训练集、测试集和训练-测试集的性能评估均呈现出较高的分类效率，AUC分别为1.00、0.932和0.98 （图1I ）。总体而言，我们确定了 CPP 和健康对照组之间的不同物种，并使用随机森林构建了分类器来区分 CPP 患者。
2. CPP 患者肠道菌群改变的功能通路
接下来，我们采用 PICRUSt 分析来预测与神经内分泌相关的代谢途径活动和肠脑模块 (GBM) 活动]。在173条代谢途径中，我们发现有25条途径在CPP中具有显着较高的活性（图 2A），包括四环素生物合成、双酚降解、溶酶体和类黄酮生物合成。同样，我们还发现一些 GBM 相关通路在 CPP 组中表现出更高的活性（图 2B ）。例如，异戊酸合成、丙酸降解和一氧化氮 (NO) 的合成。之后，我们通过基于属水平的OUT研究了物种对GBMs的贡献。NO模块主要由芽孢杆菌属、类孢子八叠球菌属和红球菌属等11个物种贡献（图 2C ）。这些结果表明，肠道微生物群的改变可能会影响对性早熟有影响的特定功能。
3. CPP 患者的粪便代谢物改变
为了进一步细化 CPP 的特征，我们对来自 150个体（包括 91 个 CPP 患者和 59 个健康对照）的粪便样本进行了非靶向代谢组学分析，并鉴定出 15,411 种可能来自微生物组和宿主的化合物（包括 8949 个正离子和 6771 个负离子） . 偏最小二乘法判别分析 (PLS-DA) 揭示了 CPP 和健康对照组之间阳性和阴性粪便代谢物的显着分离（图 3 A）。比较 CPP 和健康对照之间正离子代谢物的丰度，我们发现 1215 种代谢物在 CPP 中表达不同，其中 795 种上调，420 种下调。这些代谢物包括类脂分子、有机氮化合物、苯丙醇和聚酮化合物（图 3B–C）。此外，通过相同的方法鉴定出1255种差异显著的负离子代谢物，其中695种上调和560种下调。为了进一步了解这些差异代谢物的功能及其对宿主的影响，我们接下来进行了功能富集分析和差异丰度 (DA) 评分，以捕捉与健康对照相比通路代谢物的上调或下调趋势。最后，在我们的分析中确定了至少 3 种代谢物的 15 条途径，其中 10 条呈上升趋势（图 3E，DA > = 0.5）。这些在 CPP 中过度激活的途径主要涉及半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、组氨酸代谢和神经活性配体-受体相互作用（图 3E ）。尽管类固醇代谢没有表现出相同的趋势（图 3D ），但是三种代谢物在CPP中高表达，它们在CPP中受到干扰（图 3E ），可能影响性早熟的治疗。这些结果表明代谢物的改变和功能与 CPP 相关。因此，我们使用正离子代谢物构建分类器并识别出 52 种特征性代谢物（图 3F ）。基于正离子分类器的训练集、测试集和训练-测试集的性能评估均表现出较好的分类效率，其AUC分别为1、0.85和0.988 （图 3G ）。总体而言，我们确定了 CPP 和健康对照组之间的差异代谢物，并基于粪便代谢物构建了一个随机森林分类器。
4. CPP 患者的血液代谢组学改变
同样，我们对来自 150 个个体的血液样本进行了非靶向代谢组学分析，并识别出可能来自微生物组和宿主的 18,867 种化合物（包括 12,898 种正离子和 6193 种负离子）。PLS-DA 显示正离子和负离子粪便代谢物在 CPP 和健康对照之间明显分离（图 4A）。我们比较了两组之间正离子代谢物的丰度，发现 1026 种代谢物在 CPP 中表达不同，其中 941 种上调，85 种下调。这些代谢物涵盖类脂分子、有机氮化合物和苯环化合物的分类（图 4B-C ）。此外，使用相同的方法识别了 167 个负离子，包括 108 个上调和 59 个下调。接下来，我们使用正离子或负离子代谢物来构建分类器。我们发现分别为正离子和负离子构造的 RF 分类器都具有良好的性能。在功能富集分析并评估这些代谢物的差异丰度后，我们捕获了至少 3 种代谢物的四种途径，其中两种呈增加趋势（DA > = 0.2），另两种呈下降趋势（DA < = - 0.2）。有趣的是，这些在 CPP 中减少的途径涉及胆固醇代谢和初级胆汁酸生物合成（图 4D-E ）。这些结果表明，血液代谢物的变化和功能与 CPP 相关。粪便和血液代谢物在 CPP 组和健康对照组中具有不同的表达丰度，并且这些代谢物的表达在粪便样本中似乎更具倾向性（图 4F）。
5. CPP 中肠道细菌和粪便代谢物的关联
为了获得 CPP 组肠道菌群的代谢潜力，我们分别计算了 6 个分类水平（包括门、纲、目、科、属和种）中 CPP 组差异表达微生物和粪便代谢物的 Spearman 相关系数。该程序在合并正离子和负离子模式后使用具有注释名称的代谢物。在 262 种差异代谢物中，我们观察到 64 种代谢物与 23 种肠道微生物具有强相关性（Spearman 相关系数 > = 0.3 或 < = - 0.3，BH 校正p-值 < 0.05)。这些代谢物涉及脂质和类脂质分子、有机杂环化合物、苯环化合物、有机酸和衍生物、有机氮化合物、有机氧化合物、核苷、核苷酸和类似物（图 5A ）。发现双歧杆菌与 21 种代谢物相关（图 5B)，包括 M149T215（双酚 b）和 M431T154（α-生育酚（维生素 E）），它们呈正相关。
6. CPP 中肠道细菌和血液代谢物的关联
同样，我们分别计算了 CPP 组中 6 个水平的差异表达微生物和差异表达血液代谢物的 Spearman 相关系数。该分析还使用了带有注释名称的代谢物，这些代谢物同时考虑了正离子和负离子模式。在 99 种差异代谢物中，我们观察到 64 种代谢物与 21 种肠道微生物在 6 个水平上有很强的相关性（相关系数 > = 0.3 或 < = - 0.3，BH 校正的 p 值 < 0.05）。这些代谢物涉及脂质和类脂质分子、有机酸和衍生物、苯丙烷和聚酮化合物以及有机氧化合物等（图 6A ）。与之前的观察结果一致，我们还发现在 CPP 组中表现出更高丰度的 Blautia 属、链球菌属和双歧杆菌属与 M430T323 (Tubacin) 有很强的关联。此外，Blautia 和双歧杆菌与 M247T196（色氨酸甜菜碱，图6B）呈正相关 。
这些结果表明，CPP 组肠道微生物群的动态变化和布劳氏杆菌、链球菌和双歧杆菌的增加可能影响 NO 相关的粪便或血液代谢物，通过刺激促性腺激素释放激素的分泌导致 CPP。总体而言，与微生物群失调相关的代谢物的改变为 CPP 的诊断和治疗提供了新的见解。
