SUMO化相关基因的预后预测和免疫调节作用：前列腺癌治疗中的潜在新靶点- 大数跨境

中科生信

2023-09-15

导读：中午好！今天小编和大家分享一篇23年9月发表在International Journal of Molecu

中午好！今天小编和大家分享一篇23年9月发表在International Journal of Molecular Sciences杂志的文章《The Prognosis-Predictive and Immunoregulatory Role of SUMOylation Related Genes: Potential Novel Targets in Prostate Cancer Treatment》。前列腺癌（PCa）是男性生殖系最常见的恶性肿瘤，发病随年龄而增长，其发病率有明显的地区差异，欧美地区较高。据报道仅次于肺癌，在男性是癌症死亡的第二位。该研究阐明了SUMO修饰相关基因在PCa中的综合作用，更好地了解SUMO修饰并利用SUMO修饰相关风险评分可以帮助精准医疗并改善PCa的预后。

背景

前列腺癌（PCa）是最普遍的恶性肿瘤之一，其癌症相关死亡率在全球男性中排名第五。根治性前列腺切除术、根治性放疗和雄激素剥夺治疗是非转移性PCa的常见临床干预措施。尽管大多数低危PCa患者预后良好，但仍有一部分患者会出现疾病进展，这可能表现为转移或去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的发展。由于SUMO修饰对细胞存活至关重要，SUMO修饰失调被认为与肿瘤有关。相关研究证明，在许多类型的癌症中，SUMO修饰成分过度表达，持续的上调的SUMO修饰对于癌细胞细胞周期的进展至关重要。

方法

1，从MSigDB数据库下载174个SUMO相关基因（SRG），从TCGA数据库中收集663例PCa样本的RNA-seq和相应的临床信息，从GEO下载GSE70770和GSE46602作为外部验证数据集。

2，使用R包“limma”筛选肿瘤组织与正常前列腺组织之间的差异表达基因，筛选阈值设置为:|log2 (FC)| > 1和FDR < 0.5。通过R软件包“pheatmap”将基因表达差异可视化为热图和火山图。通过差异表达基因与SRG取交集鉴定出差异表达的SRG。

3，在TCGA-PCa中通过单变量Cox回归来选择具有预后价值的差异表达的SRG。P < 0.05被认为差异有统计学意义。研究PCa患者中这些重要SRGs的突变图谱和共突变状态。

4，在获得具有预后价值的SRG后，使用LASSO完成非零系数潜在基因的最终选择。基于多变量Cox回归的相应系数加权的归一化基因表达水平构建风险特征。将患者分为两组，即高危组和低危组，以中位风险评分为临界值。通过生存分析来评估两组患者的预后差异。通过两个验证集GSE70770和GSE46602进一步验证预测模型。

5，使用Wilcoxon检验来研究风险评分与临床特征的相关性，并通过单/多变量Cox回归评估其独立预后价值。

6，绘制受试者工作特征(ROC)曲线，比较不同临床病理因素和风险评分的预测疗效。

7，构建包含临床因素和风险评分的nomogram来预测生化复发(BCR)的发生概率。

8，根据TCGA-PRAD队列的体细胞突变谱计算肿瘤突变负荷(TMB)。绘制两个风险组的前20个突变基因的分布图。评估TMB与风险评分的相关性。

9，通过7种算法(QUANTISEQ、CIBERSORT、EPIC、CIBERSORT- abs、XCELL、TIMER和MCPCOUNTER)从TIMER 2.0数据库估计免疫细胞和体细胞在TME中的浸润水平。计算风险评分与TME免疫细胞浸润的相关性。

10，比较两个不同风险组中几个重要免疫检查点基因的表达水平。采用ESTIMATE算法研究PCa肿瘤的纯度。

11，使用R“oncoPredict”包预测常用治疗药物的药物反应，并比较两个风险组之间的差异。

12，使用TCIA评估每个样本对CTLA-4或PD-1阻断的反应，并比较CTLA-4和PD-1两个风险亚组。

13，通过“clusterprofiler”软件包进行GSEA分析，并由“GSVA”软件包进行GSVA分析，以确定筛选的候选基因、风险评分和SUMO修饰相关途径之间的相关性。

14，细胞培养及RNA和蛋白质的提取。

15，RT-qPCR,，Western Blotting和免疫组织化学染色实验。

结果

1，从TCGA-PRAD、GSE46602和GSE70770三个独立队列中共获得663例患者纳入分析。将TCGA-PRAD队列按3:2的比例随机分为TCGA_train和TCGA_test两个队列。比较SRGs在TCGA数据库中前列腺癌组织与邻近非肿瘤组织中的表达水平。差异表达SRG的景观显示为火山图(图1A)和热图(图1B)，其中包括29个上调SRG和10个下调SRG。通过单变量cox回归模型，最终筛选出11个高危SRG和1个保护性SRG，该模型与前列腺癌BCR紧密相关(图1C)。此外，在484例前列腺肿瘤样本中，这12个基因的突变频率仅为2.27%，且多个基因之间存在同时突变(图1D,E)。这些发现表明，这些预后SRG是高度稳定和联系的。

2，使用LASSO回归和10倍交叉验证从12个候选基因中筛选出最重要的SRG(图2A,B)。最后，选择两个SRG(DNMT3B和NUP210)，采用多变量Cox回归分析构建预后模型。这两个基因对BCR的危险比(HR)如图2C所示，表明它们都是前列腺癌BCR的显著危险因素。

3，根据公式计算TCGA队列中每个患者的风险评分，将这些患者分为高风险(n=212)和低风险(n=212)亚组，中位数为1(图2D)。随着风险评分的增加，BCR患者的比例增加(图2E)，在所有TCGA-training队列(图2F)、TCGA-test队列(图2G)和整个TCGA-PRAD队列(图2H)中，高危组患者的无BCR生存率均低于低危组患者。

4，研究了风险评分与年龄(≤65和>65)(图2I)、N类(N0和N1)(图2J)、T类(T2、T3和T4)(图2K)等临床特征之间的关系。发现较高的风险评分与病理分期的增加显著相关，这意味着较差的预后。

5，如图2L所示，在单因素和多因素Cox回归分析中，M、T类别和风险评分均为BCR的独立预后预测因子。

6，风险评分绘制的ROC曲线的曲线下面积(AUC)为0.708，高于年龄(AUC=0.567)、T类(AUC=0.649)和N类(AUC=0.536)(图2N)。这些结果表明我们构建的预后模型具有良好的特异性和敏感性。

7，通过两个验证集进行验证，发现无论是在GSE70770队列中(图3A)，还是在GSE46602和GSE70770合并的meta队列中(图3B)，高危组患者的预后都明显较差。采用随机效应模型对4个独立队列进行meta分析，计算风险评分对前列腺癌预后的总HR(图3C)。发现风险评分的合并HR为1.17 (95% CI: 1.03-1.33)，这表明风险评分是前列腺癌BCR的有效危险因素。

8，利用风险评分和T分期构建了预测前列腺癌患者1、3、5年BCR概率的nomogram图，多因素Cox回归分析结果具有统计学意义(图3D)。如nomogram所示，我们随机选择1例高危评分和T4分期的患者，计算总积分为139分，对应的1年、3年、5年无BCR生存概率分别为0.92、0.711、0.624。1年、3年、5年的ROC曲线AUC分别为0.633、0.675、0.708，预测效率有所降低(图3E)。1、3和5年的校准曲线在实际BCR概率和预测BCR概率上表现出极好的一致性(图3F)。综上所述，说明建立的模型在外部队列中显示出强大的识别能力，nomogram可以很好地预测前列腺癌患者的BCR。

9，分析了低危组(图4A)和高危组(图4B)前20个基因中TMB的频率。发现高危组的总突变频率(62%)高于低危组(43.41%)。而对于前列腺癌中常见的一些突变位点，如TP53、FOXA1，高危组的突变频率明显更高。如图4C、D所示，TMB与风险评分显著正相关。此外，TMB高的患者无BCR生存期更差(图4E)。将TMB和风险评分结合起来，可以将患者分为4个亚组，发现风险评分高、TMB高的患者临床预后最差(图4F)。综上所述，TMB与风险评分相结合对前列腺癌患者的预后有较好的预测能力。

10，评估了TME与风险评分的关系。研究了不同风险评分组中各种常见免疫检查点(ICP)基因的表达水平，发现大多数ICP在高危组中上调，如CD276、CTLA4和NRP1(图5A,B)。发现CD276的表达与风险评分显著正相关，这表明风险评分可能是评估靶向B7-H3治疗效果的一个预测指标。使用ESTIMATE算法，探讨了风险评分与肿瘤纯度之间的关系(图5C)。发现低危组的基质评分、免疫评分和估计评分均显著高于高危组，说明高危组肿瘤纯度较高，免疫细胞浸润较低。利用7种算法评估肿瘤微环境特征与风险评分之间的关系(图5D,E)。

11，根据患者抗PD-1和抗CTLA-4免疫疗法的使用情况将患者分为4个亚组:CTLA-4阴性PD-1阴性(图6A)、CTLA-4阴性PD-1阳性(图6B)、CTLA-4阳性PD-1阴性(图6C)和CTLA-4阳性PD-1阳性(图6D)。发现所有这些亚组的IPS评分都明显低于低危组，这表明低危组患者可以从免疫治疗中获益更多。使用oncoPredict包预测一些常用化疗药物的疗效，发现高危组的敏感性评分明显较低，表明化疗反应较好(图6E-I)。总之，研究结果表明，与免疫治疗相比，化疗可能对高风险评分的患者更有益。

12，通过GSEA分别探索了高风险和低风险亚组中激活的信号通路。发现在低风险亚组中，被激活的前5条HALLMARK通路分别是“脂肪生成”、“上皮间充质转化”、“雌激素反应晚期”、“肌生成”和“氧化磷酸化”(图7A)。相比之下，高危亚组中富集最多的5条信号通路分别是“E2F靶点”、“G2M checkpoint”、“干扰素α反应”、“有丝分裂纺锤体”和“MYC靶点V1”(图7B)。此外，GSVA显示，风险评分与Wnt/β-Catenin信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路和MYC信号通路呈正相关，这些信号通路与细胞生长和肿瘤发生有关(图7C)。

13，分析了SUMO修饰风险模型中两个重要基因的表达。与正常组织相比，PCa组织中DNMT3B(图8A)和NUP210(图8B)的表达水平上调。RT-qPCR显示mRNA水平的表达水平，发现NUP210在PCa细胞系中的表达水平明显较高(图8C)。没有发现PCa细胞系与正常前列腺细胞系之间DNMT3B的显著差异(图8D)，需要进一步的研究。Western blotting显示，NUP210在前列腺癌细胞系中显著富集，而在正常前列腺上皮细胞系中则明显富集(图8E)。

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