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与m5C 相关的长非编码 RNA 的结直肠癌新型预后模型的鉴定和验证
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与m5C 相关的长非编码 RNA 的结直肠癌新型预后模型的鉴定和验证

与m5C 相关的长非编码 RNA 的结直肠癌新型预后模型的鉴定和验证 中科生信
2023-09-11
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导读：早！今天小编和大家分享一篇23年9月发表在Cancer Cell International杂志的文章《Id
早！今天小编和大家分享一篇23年9月发表在Cancer Cell International杂志的文章《Identification and validation of a novel prognosis model based on m5C-related long non-coding RNAs in colorectal cancer》。CRC的治疗现状并不乐观，与许多癌症的发生与进展有关的lncRNA以及m5C在CRC的影响尚不明确。

背景
根据2020年全球癌症统计，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率位居全球第3位，死亡率位居第2位。目前主要治疗手段有手术、内镜下切除、辅助化疗、放疗、靶向治疗等。尽可能杀死肿瘤细胞，减少肿瘤细胞数量是肿瘤治疗的最终目标，从而达到提高患者生存率，改善患者预后的目的。然而，目前CRC的治疗现状并不乐观，具有高转移率、高复发率、高耐药率的特点。5-羟甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）是mRNA修饰的一种，在多种mRNA中都有发生，会影响RNA的稳定和翻译。有研究表明，m5C会影响癌症的进展。
而长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种广泛分布于人类基因中的非编码RNA，参与形成复杂的基因表达调控网络，调控各种生物过程。许多研究证据表明，与m5c相关的基因对lncRNA甲基化水平的调控，会影响肿瘤的发生和发展。
以往的生物信息学研究侧重于RNA的改变，而作者则是对CRC中的m5C调控因子进行全面研究。在这项研究中，作者使用了TGCA数据集中与m5C相关的lncRNAs表达数据，筛选具有预后意义的m5C相关lncRNA，建立了m5C相关lncRNA的预后模型，并进一步研究了免疫细胞浸润与m5C相关lncRNA之间的关联。这篇文章的目的是探索CRC中m5C相关lncRNA的甲基化的免疫微环境、对肿瘤的影响和预后价值，从而为CRC的管理提供指导。

方法
1，从TCGA数据库中下载CRC的mRNA和lncRNA数据以及相关信息。
2，从以往研究和TCGA数据库中下载甲基化调节因子和表达矩阵。
3，分析在CRC中差异表达的甲基化调节因子。
4，相关性分析，得到与甲基化调控因子相关的lncRNA。
5，对与甲基化调控因子相关的lncRNA进行单因素cox与LASSO分析，并构建风险模型。
6，分析高低风险组的生存差异、不同临床特征中的差异，以及甲基化调控因子相关的lncRNA对CRC生存期的影响。
7，预后分析与列线图的构建。
8，富集分析。
9，免疫浸润分析。
10，突变分析。
11，细胞实验验证。

结果
1.总共从TCGA获取CRC样本548个，癌旁样本44个纳入研究，使用GENCODE网站对lncRNA进行注释，得到13142个lncRNA。从已发表文献中获得与m5C相关的12个调节因子，构建这12个调节因子的PPI网络如图所示。随后，对11个比对到TCGA数据的调节因子进行差异分析发现NSUN2、NSUN5、NSUN4、NSUN7、NSUN6、DNMT3B、DNMT1和ALYREF在CRC中显著上调，而NSUN3和TET2显著下调，暗示着m5C调节因子与CRC的潜在相关性。


2.从m5C调节因子和lncRNA的相关性分析中，筛选出574个与m5C调节因子显著相关的lncRNA用于后续分析（筛选条件：p<0.001；|相关性系数|>0.3）。随后对这些lncRNA进行单因素cox回归分析，选出13个与预后显著相关的lncRNA（p<0.05），其中大多数是CRC的危险因素（HR>1），而AC073896.3、AC008494.3和TNFRSF10A-AS1是保护因素（HR<1）。使用LASSO对这13个lncRNA进行进一步筛选，得到11个lncRNA并构建风险模型。这些lncRNA与m5C调节因子以及CRC的关系如图所示，并且在TCGA和GEO的相应数据集中都有显著表达差异。基于风险评分的中位值，将所有CRC样本分为高、低风险组，KM生存分析发现组间存在显著生存差异，风险评分越高，死亡率越高。


3.进一步分析用于构建风险模型的11个lncRNA的表达对CRC的生存期的影响，发现8个lncRNA是CRC的危险因素，高表达的个体具有较短的生存时间；2个lncRNA是CRC的保护因素，高表达的个体具有更长的生存时间。在这11个lncRNA中，TNFRSF10A-AS1作为自噬相关的长非编码RNA在结直肠癌患者中被分析报道。研究表明，MPZL1是TNFRSF10A-AS1的直接下游效应子，是其致癌作用所必需的。TNFRSF10A-AS1通过miR-3121-3P/HUR轴促进CRC的发生和发展，因此TNFRSF10A-AS1有可能成为治疗该病的新靶点。而其余的lncRNAs很少被报道。风险评分在不同的肿瘤stage分期，TNM分期中具有显著差异。


4.结合临床信息与风险评分的单、多因素cox回归分析结果说明了风险模型可以作为独立的预后因子，并且1，3，5年的ROC分析结果显示了风险模型相较于其他临床信息的优越性。随即将TCGA数据分成A组和B组，高风险组的生存期在两组中都较差。除此之外，基于风险分数还构建了一个列线图，更适用于日常的临床工作。


5.PCA结果也说明了与m5C相关的lncRNA的可以将CRC患者分成两类。GSEA结果发现高风险个体富集于苯丙氨酸代谢、Notch信号传导和花生四烯酸代谢的通路，而低风险个体则富集于CRC和P53信号通路。GSVA富集分析显示，m5C相关lncRNA与肿瘤进展相关通路显着相关，如KRAS信号通路、PI3K-AKT-mTOR信号通路、MYC靶点和TGF-BETA信号通路等。GSEA分析指出了未来研究的几个途径：苯丙氨酸代谢在癌症研究中越来越受到关注，本研究结果表明，苯丙氨酸水平具有重要的潜在病因学和诊断意义，在CRC发病和进展的初始阶段，代谢组和微生物组发生了改变。p53信号通路中的肿瘤抑制蛋白p53被称为基因组的守护者。p53参与多种生物反应的激活，主要包括细胞周期阻滞、DNA修复和凋亡。p53的激活是由多种应激信号介导的，包括缺氧、DNA损伤和强增殖信号。在大约90%的癌症中可以检测到p53功能的失调，包括TP53突变或其他上游因子的异常激活。


6.如图所示，作者对免疫细胞以及免疫评分之间的相关性进行了分析，cibersort算法显示了28种不同的免疫细胞在不同样本中的分布，部分免疫细胞在不同分组种有显著差异，高危组NK细胞明显上调。虽然已有报道发现CD8+T细胞、M1和M2 TAMs在CRC的发生发展中起重要作用，但由于NK细胞在肿瘤微环境中的高密度浸润对抑制CRC、肺癌等实体瘤的生长和转移也很重要，其在免疫治疗中的作用也逐渐被认识。免疫细胞于风险评分的相关性分析结果显示，嗜酸性粒细胞和T细胞与风险评分高度负相关，而风险评分与B细胞记忆强烈正相关。从TIDE数据库获取的MSI评分显示了高、低风险组的显著差异，暗示着低风险组对免疫治疗的反应较好。上述结果提示M5C调控的相关lncRNAs可能参与了肿瘤微环境中的免疫调节过程。此外还从ImmPort数据库中获得了高、低风险组中具有差异的6个免疫相关途径。


7.本研究分析了CRC样本和SMG突变谱，以探索免疫细胞浸润与突变模式之间的联系。结果显示TP53、TTN和KRAS等突变比例显著。肿瘤抑制基因TP53是肿瘤中最常见的突变基因。TP53的突变调节了P53促进细胞凋亡和铁蛋白体的能力，并参与了包括CRC在内的多种肿瘤的进展。KRAS基因的突变与CRC的发生、发展、预后以及药物治疗和放射治疗有着千丝万缕的联系。至于TTN，在结直肠癌的研究中还很少有人研究。结果表明，低危组具有信号的独立性。这些结果提示低危组的突变模式与缺陷的DNA错配修复有关。此外，通过应用Prrophetic R包对两组化疗反应进行了预测性分析。低危组患者对顺铂药物的敏感性较高。高危组患者对吉非替尼、甲氨蝶呤、舒尼替尼的敏感性较高。而顺铂作为临床常用的化疗药物，与氟尿嘧啶(5-FU)、奥沙利铂一起，是治疗结直肠癌最有效的化疗药物。


8.选择TNFRSF10A-AS1对m5c调控的lncRNA进行体外验证，探讨m5c调控的lncRNA在结直肠癌细胞中的作用。使用Procell提供的人类正常细胞系NCM460；CRC细胞系SW620、HCT116、SW480、DLD1、Lovo和HT29，将SW480和SW620结直肠癌细胞分为靶向TNFRSF10A-AS1的siRNA（si-TNFRSF10A-AS1）和阴性对照（si-NC）两组。Q-PCR结果显示，TNFRSF10A-AS1在人正常结直肠细胞株NCM460中的表达水平高于在CRC细胞株SW480、SW620、DLD1、HCT116、HT29和Lovo中的表达水平。创面愈合试验、CCK-8试验、克隆形成试验和Edu试验结果显示，TNFRSF10A-AS1显著降低了CRC细胞的增殖能力。24h创面愈合试验显示，TNFRSF10A-AS1在CRC细胞中的降低降低了细胞的迁移能力，TNFRSF10A-AS1对CRC细胞的增殖、迁移和侵袭有显著影响。



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