39.3高分文章：单细胞测序和空间转录组学揭示了间质性膀胱炎的免疫景观- 大数跨境

中科生信

2023-09-19

导读：大家好！今天小编和大家分享一篇发表在Nature子刊Signal Transduction and Targ

大家好！今天小编和大家分享一篇发表在Nature子刊Signal Transduction and Targeted Therapy(IF:39.3)杂志的文章《Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis》。研究使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对15名间质性膀胱炎（IC）女性患者和9名压力性尿失禁对照者的135,091个CD45⁺免疫细胞进行了测序，在构建的图谱中发现了22个免疫亚群。通过整合scRNA-seq和空间转录组学（ST）的结果，我们发现在IC患者膀胱中，几乎所有的免疫亚群都富集在尿路上皮区域或靠近成纤维细胞的位置，但在对照膀胱中，它们是在尿路上皮和平滑肌细胞周围被发现的。这些发现描绘了IC的免疫图谱，或许能为IC的病理生理学提供有价值的见解。

背景

IC又称膀胱疼痛综合征，以强烈的骨盆疼痛和排尿症状为特征，是一种严重衰弱的慢性疾病。其发病率从0.01%到6.5%不等，女性患者约为男性患者的五倍。由于IC的病因和病理生理学仍是一个谜，这给诊断和治疗带来了困难。虽然没有人能够确定IC是否是一种自身免疫性疾病，但目前的证据表明，免疫可能在IC的发展过程中起着重要作用。因此，我们旨在研究IC膀胱中的免疫状况（免疫细胞亚群的分布）以及免疫可能参与IC进展的特定阶段。以往研究IC分子通路的方法主要是通过流式细胞术、病理特征描述以及芯片基因表达等方法对膀胱组织、血液和尿液进行无偏见分析。至于它们能在多大程度上反映炎症状况、细胞亚群和免疫状态，目前还不得而知。

scRNA-Seq能够揭示细胞类型中不同的亚群，已成为捕捉疾病中免疫浸润复杂特征的有力工具。将scRNA-seq与质量细胞测定法（飞行时间细胞测定法（CyTOF））相结合的方法已被用于确定类风湿性关节炎关节滑膜组织中的炎症细胞状态。为了更好地了解免疫在IC膀胱中的作用，我们首先通过scRNA-Seq结合CyTOF对免疫参数（仅使用CD45⁺单细胞）进行了全面的表型和功能研究。然后，通过多模态交叉分析将scRNA-Seq得出的免疫观点与ST的结果进行整合。本研究的发现揭示了IC患者膀胱的免疫图谱，为今后的病理生理学研究和治疗铺平了道路。

研究结果

1.IC患者膀胱中CD45⁺免疫细胞的单细胞转录特征

为了破译和构建IC的免疫图谱，研究人员应用scRNA-seq来检查隐藏在群体平均测量结果中的转录组异质性（图1a）。通过膀胱镜检查确定了IC膀胱壁的特征性病理特征显示，与对照组相比，IC膀胱中尿路上皮变性或解剖学缺失、血管生成和免疫细胞浸润是常见的（图1b）。对来自IC患者和对照组的膀胱标本进行新鲜采集、解剖并消化成单细胞。从24个样本中共分离并测序出135,091个CD45⁺免疫单细胞。经过严格的质量控制后，共对92029个高质量的CD45⁺免疫细胞进行了进一步分析（图1c）。细胞计数与基因之间的相关系数很高（R=0.8995），但细胞计数与线粒体基因之间的相关系数不高（R=-0.006）（图1d）。通过PCA进行降维，然后使用UMAP方法进行可视化。共检测到七种细胞类型，其中包括T细胞，这些细胞类型的造血和组织系决定基因最易区分：CD3E（51,193个，55.6%），B细胞：CD79A（20,090，21.8%），髓系细胞：LYZ和CST3（14,656，15.9%），成纤维细胞：COL1A1和LUM（3764，4%），上皮细胞：KRT19和UPK1B（1096，1.19%），NK细胞：CD56/NCAM1、CD16/FCGR3A和NKG7（864，0.94%），以及内皮细胞：CD31/PECAM1（366，0.39%）（图1e-h）。在剔除双倍细胞后，当前的细胞结构由94.42%的CD45⁺免疫细胞和5.58%的CD45^-单细胞组成（图1h）。IC膀胱中检测到的免疫细胞包括T细胞、B细胞、浆细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞。然而，进一步分类的细胞类型，如调节性T细胞（Treg）、自然杀伤性T细胞（NKT）、CD56bright CD16low NK细胞、开关/非开关记忆B细胞（SMB/USMB）、M2样巨噬细胞以及树突状细胞（DC）却鲜有报道。通过对这些细胞的鉴定，可以描绘出IC患者更复杂、更完整的免疫图谱。

2.对T细胞系和B细胞系进行逐步聚类，发现CD8⁺T细胞功能失调，B细胞活化异常

为了描述IC组和对照组之间单个T细胞亚群的变化，我们对T细胞进行了亚群划分，并根据典型T细胞标记物的表达获得了9个亚群。我们确定了5个CD4⁺T细胞群、3个CD8⁺T细胞群和1个NKT细胞群（图2a）。

在CD4⁺T细胞区系中，如图2所示，有两个辅助性T细胞群，包括Tregs（FOXP3、CTLA4和IL-2RA）和滤泡辅助性T细胞（Tfh）（MAF、CXCL13、ICOS和PDCD1）。在CD4⁺T细胞区系中，如图2b所示，通过其独特的转录因子和标记物的表达，我们发现了两个辅助性T细胞群，包括Tregs和Tfh。我们发现Tregs中几乎检测不到IL-10（一种重要的抗炎细胞因子），这可能意味着IC组的免疫调节紊乱。然后，我们观察到一个TH17辅助细胞(Th17)簇，它上调了特定于th17的RORA基因，使其成为th17细胞转录因子。随后，我们又发现了一个CD3D⁺T细胞集群，其特征是与NK细胞活性相关的典型基因（如NCAM1、FCGR3A、PRF1、NKG7和GNLY）的高表达，使它们成为NKT细胞。最后，效应记忆CD4+ T细胞（CD4+Tem）通过其CCL5、CXCR6和PRDM1的高表达被识别，中心记忆CD4+T细胞（CD4+Tcm）通过其IL-7R、CCR7和SELL的表达被识别。CD69和ICOS在这些集群中上调，表明这些细胞更有可能是CD4+Tcm，而不是幼稚T细胞。TCF7和KLF2的表达表明了早期中枢记忆T细胞表型（图2b）。

对T细胞亚群比例的分析表明，IC膀胱中Treg细胞显著增加，Th17细胞减少（图2c）。对IC组与对照组相比的差异表达基因（DEGs）进行了GO和KEGG富集分析。Tregs的DEGs主要富集于mRNA分解过程、病毒受体和病灶粘附（图2d）。然而，Th17细胞的DEGs主要富集在经典的炎症信号通路中，如IL-17信号通路和NF-kappa B信号通路（图2e）。

通过CD8A和细胞毒性基因（GZMA、GZMK、GZMB、NKG7和PRF1）的高表达水平，发现了两个CD8⁺效应T细胞（CD8⁺Tef）群。属于CD8⁺Tef的细胞高度表达细胞毒性标志物，而GZMK⁺CD8⁺T细胞集群中的细胞具有最高水平的GZMK，而不是GZMA或GZMB。活化的CD8⁺T细胞（ActCD8⁺T）是指表达TRAC、TRBC1和ACTB等活化基因的细胞，但其细胞毒性活性相对较低（图2a，b）。不出所料，IC组衰竭基因的表达水平相对高于对照组（图2f，g），这表明CD8⁺T在这种慢性疾病中功能失调。

为了进一步研究B细胞亚群的转录变化，我们对B细胞进行了亚群分类，发现了6个B细胞亚群（图2h），包括幼稚B细胞（CD27^-IGHM⁺IGHD⁺）、过渡B细胞（TBCs）（CD27^- CD24⁺ IGHMlow IGHDlow）、活化B细胞（CD27⁺ CD86⁺ HLA^-DRA⁺）、未切换记忆B细胞（USMBs）（CD27⁺ CD38⁺ IGHMlow IGHDlow）、切换记忆B细胞（SMBs）（CD27⁺ IGHM^- IGHA1⁺ IGHG1⁺ IGHE⁺）和浆细胞（MZB1⁺ XBP1⁺）（图2i）。

活化B细胞和USMB明显增加，SMB和TBC减少（图2j）。IC组的大多数B细胞都是活化B细胞（46.32%），这表明IC组的B细胞活化程度越来越高。虽然检测到了可能表明年龄相关B细胞的基因表达特征，但老化相关基因的表达水平在IC组和对照组之间没有显著差异（图2k）。B细胞的异常活化和浆细胞的识别意味着IC患者可能会发生强大的体液免疫反应。因此，检测了IC患者和对照组血浆和尿液中的免疫球蛋白，包括IgA、IgM、IgG和IgE。虽然两组患者血浆中的所有免疫球蛋白均无统计学差异，但IC患者尿液中的IgE显著增加（图2l），提示IgE是IC潜在的尿液生物标记物。

3.髓系细胞群的分类和注释揭示了免疫相关巨噬细胞

然后，我们对髓系细胞的分子和功能差异进行了划分。我们鉴定了六种细胞类型，包括中性粒细胞（CXCR2和FCGR3B）、炎性CD14+巨噬细胞（CD14和CD68）、M2样巨噬细胞（C1QA和VSIG4）、传统树突状细胞（cDC）（CLEC9A和FLT3）、浆细胞树突状细胞（pDC）（CLEC4C和LILRA4）和肥大细胞（TPSAB1和KIT）（图3a）。IC膀胱中的大多数髓系细胞是中性粒细胞（51.20%），而不是肥大细胞（图3b）。KEGG分析显示，与对照组相比，IC组中性粒细胞的DEGs在抗原处理和呈递以及类风湿性关节炎通路中显著富集（图3c）。伪时间分析描绘了从CD14⁺巨噬细胞到M2样巨噬细胞的主流发展轨迹（图3d、e）。在分化过程中，促炎基因（IL-1β、S100A8和NLRP3）在CD14⁺巨噬细胞中上调，但随着时间的推移逐渐下调。同时，吞噬基因和调节受体（CD163、FOLR2、STAB1、C1QA和MSR1）在M2样巨噬细胞中逐渐上调（图3f）。与对照组相比，炎性CD14⁺巨噬细胞的功能与炎症产生有关，如IL-6的产生和NF-kappa B信号调节（图3g）。然而，M2样巨噬细胞主要通过MHC II类分子调节免疫（图3h）。此外，M2样巨噬细胞的DEGs主要富集于自身免疫性疾病，如多发性硬化症和格林-巴利综合征（图3i）。为了验证两种不同巨噬细胞的存在，对CD68、S100A8和CD163进行了免疫荧光染色（图3j）。

4.通过CyTOF确认免疫表型异质性

进行了CyTOF分析，以确定IC患者膀胱内免疫亚群的特征，并验证scRNA-seq结果（图4a）。图4b中显示了每个群中所选标记物的蛋白质水平。图4b在构建的图谱中确定了来自IC患者和对照组的40个集群（图4b、c）。捕获CD45⁺免疫细胞进行CyTOF分析（图4d）。根据标准标记，确定了不同的细胞亚群，包括CD4⁺T细胞（CD3⁺CD4⁺）、CD8⁺T细胞（CD3⁺CD8⁺）、B细胞（CD19）、巨噬细胞（CD68）、DC细胞（CD11C）、肥大细胞（KIT）和活化细胞（HLA-DR），推测的细胞类型与scRNA-seq的结果一致（图4e）。这些数据与基于scRNA-seq的集群定义一起，帮助验证和建立了IC膀胱中的细胞免疫细胞图谱。

5.IC的免疫激活网络

为了确定IC组细胞活化之间潜在的相互作用，分析了相应受体和配体（仅趋化因子、细胞因子及其受体）的表达模式。相互作用对主要分布在内皮细胞、巨噬细胞、cDCs和CD4⁺Tem的表面（图5a）。基于IC组前50个相互作用对的免疫激活网络见图5b。此外，我们发现两种趋化因子受体（FGFR1和FGFR2）几乎在所有细胞亚群中都有表达，但它们的配体（FGF2和FGF10）主要在成纤维细胞中表达（图5c）。此外，这些配体在IC组的表达水平高于对照组，这些发现意味着上皮细胞和成纤维细胞可能协调了免疫细胞在IC膀胱中的转移。不过，需要注意的是，我们只纳入了CD45⁺细胞进行下游分析，因此5.58%的CD45^-细胞不具有代表性（图1h），需要进一步研究来验证这些结果。

炎症因子（TNF、IFNG和IL-1β）的高表达水平表明IC膀胱中存在强烈的炎症反应（图5d），这与之前的研究结果相吻合。酶联免疫吸附试验证实，尿液中的CCL5含量很高，而血液中的含量则不高（图5e），因此CCL5有可能成为IC的尿液生物标志物。

IL-10和IL-35表达下降（图5f），Tregs中TGF-β信号通路表达上调（图5g），提示IC膀胱中Tregs功能失调，表明它们可以作为潜在的治疗靶点。除了参与免疫反应外，IC患者上皮细胞的DEGs还富集于人类乳头瘤病毒感染以及病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用（图5h）。成纤维细胞的富集分析也得到了类似的结果（图5i）。随后，预测出了IC膀胱上皮细胞的前5个转录因子，包括NR2F1、FOXA1、HOXD1、TBX2和OVOL1（图5j）。值得注意的是，NR2F1与HIV感染有关。关于比例变化较大的细胞类型（Tregs、Th17、Act Bs、SMBs、USMBs和中性粒细胞），我们回顾了这些细胞中DEGs的功能结果，发现它们都与病毒感染有关（图5k）。综上所述，我们推断出病毒感染可能是导致IC的潜在原因之一。因此，我们收集了20名IC患者和14名对照者的尿液样本进行病毒检测。值得注意的是，在IC尿液中检测到人类多瘤病毒-2，阳性率高达95%（19/20），而在对照组尿液中却未发现该病毒（图5l）。这一发现将为IC的病因学和病理生理机制提供新的线索和理论依据，应设计更多的工作和研究来深入研究受感染的细胞类型及其关键受体，以找到治疗IC的潜在靶点。

6.ST证明了IC尿路黏膜中免疫细胞的聚集情况

为了生成无偏见的组织切片转录组图谱，将来自3名IC患者和3名对照组的6个膀胱组织样本安装到空间条形码ST芯片载玻片上（图1a）。经过苏木精和伊红（H&E）染色和明视野成像后，玻片被用于观察明显的组织学特征。经过标准质量控制后，使用Seurat方法进行了降维，并通过T-SNE实现了可视化。根据每个聚类中的DEGs，进行逐步单元聚类以构建ST图谱。

图6a展示了第一张IC膀胱ST图。观察到基因与UMIs之间存在很强的相关性（图6b）。检测到了平滑肌细胞（SMC）（DES、ACTG2和CNN1）、尿路上皮细胞（KRT19）、肌成纤维细胞（ACTA2）、间质细胞（ISC）（VIM和KRT13）和肥大细胞（KIT）的标记基因（图6c）。描绘了膀胱壁的完整结构，包括尿道区域、固有层和肌层（图6d）。包括FN1、TGF-β1、COL1A1和COL3A1在内的纤维化基因在各种细胞类型中均有高表达，这可能表明膀胱结构最终会出现严重的纤维化（图6e）。图6g显示了对照组膀胱的第一张ST图。基因与UMI之间的相关系数为0.98（图6h）。发现了SMC、ISC、成纤维细胞（COL1A2）、肌成纤维细胞和尿路上皮细胞（图6i，j）。然而，对照组细胞中纤维化基因的表达水平较低（图6k）。

有趣的是，我们注意到在IC的ST图中，一些免疫细胞聚集在尿路上皮细胞中，如第二张ST图（图7a、b）中的T细胞和第三张ST图（图7d、e）中的浆细胞。然而，在对照组膀胱的ST图中没有观察到这种聚集现象（图7g、h、j、k）。这些结果进一步凸显了尿路上皮在IC发生过程中的重要作用。

7.免疫亚群图谱揭示了免疫细胞在IC和对照组膀胱组织中的分布差异

为了确定免疫细胞在IC膀胱中的位置，我们采用了多模态交叉分析(MIA)来解释整个组织的空间限制图谱。我们发现几乎所有的免疫亚群，如巨噬细胞、Tregs、常驻记忆CD8⁺T细胞、浆细胞、pDCs、cDCs、NKT细胞、幼稚B细胞和中性粒细胞，都富集在IC膀胱的尿道区域或靠近成纤维细胞的位置（图6f和图7c，f），但在对照组膀胱中，它们被发现在尿路上皮和平滑肌细胞周围（图（6l和图7i，l）。值得注意的是，只有一半的免疫细胞亚群在对照组膀胱的尿路上皮区域被发现。IC膀胱和对照膀胱中三个样本的结果高度一致。MIA的研究结果证实了上皮细胞和成纤维细胞在IC的发展过程中起着重要作用。总之，我们成功地构建了空间水平的免疫图谱，并描述了IC膀胱中免疫网络的特征。

8.总结

目前，研究人员一直专注于寻找可能的尿液和血清生物标志物，以早期发现IC患者。先前的研究表明，IC患者尿液中的炎性细胞因子（包括IL-2、IL-6、IL-8、IL-33和IL-17A）升高，其中IL-33在IC患者尿液中显著升高。在本研究中，除IL-1β、TNF和IFNG外，CCL5也在大多数免疫细胞中表达，IC患者尿液中CCL5的分泌增加也证实了这一点。在膀胱肿瘤、尿路感染、输尿管肾盂连接处梗阻和IC中，CCL5上调。由于肿瘤、感染和信息属于排除标准的内容，CCL5可能是IC的潜在生物标记物。关于血清中的抗体，IC患者血清IgE的增加与之前的研究结果一致。虽然以细胞因子尿液水平作为IC诊断标志物的方法已经确立，但将几种不同的尿液细胞因子（如CCL5与尿液中IgE的组合）作为非侵入性标志物可能会提高结果的准确性。虽然本研究证明炎症或免疫在IC的发展过程中起着重要作用，但它似乎更可能是上皮屏障被破坏后的下游表现。今后还需要更多的研究来揭示这一课题。

总之，我们构建了IC女性患者膀胱的免疫图谱，然后确认了这些免疫细胞亚群的特征，并阐述了它们之间的关系和相互作用。这项研究开创了研究IC免疫图谱的先例。免疫图谱可为了解IC的病理生理学提供深刻见解，并为今后诊断和治疗该疾病奠定基础。

【声明】内容源于网络

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