Establishment of nucleic acid sensing pathways‐based model in predicting response to immunotherapy and targeted drug in hepatitis virus‐related hepatocellular carcinoma（建立基于核酸传感通路的模型，预测肝炎病毒相关肝细胞癌对免疫疗法和靶向药物的反应）
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）占肝癌的80%，而70%-80%的HCC是由慢性肝病引起的，乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染是主要病因。免疫疗法正成为治疗HCC的支柱疗法，但显著的免疫介导反应仅限于少数患者。核酸感应（Nucleic acid sensing，NAS）通路是先天性免疫系统和病毒感染抗病毒免疫反应的核心通路，但其在肝炎病毒相关HCC中的作用仍不确定。本研究中，我们基于从多个公共数据集收集的肝炎病毒相关HCC组织的转录组数据进行了全面的生物信息学分析。根据病毒相关HCC患者的NAS相关基因验证了两个亚组，并根据NAS相关基因的表达将其定义为NAS激活亚组和NAS抑制亚组。在此基础上，建立了NAS相关风险评分（NASRS）预测模型用于肝炎病毒相关HCC（TCGA-LIHC和ICGC数据集）的风险分层和预后预测。在多个数据集中也验证了NASRS对预后和免疫疗法的预测价值。还建立了一个列线图以促进NASRS的临床应用，并通过不同方法证明其有效性。此外，我们还通过分子对接预测了与NAS特征核心靶点相结合的六种潜在药物。随后，我们在体外和体内评估了潜在药物的细胞毒性。基于这些结果，我们得出结论：NASRS模型可作为有力的预后生物标志物预测对免疫疗法的反应，这对肝炎病毒相关HCC患者的临床决策具有重要意义。
一、肝炎病毒相关HCC中与NAS相关基因相关的免疫亚型的建立。
（A）从TCGA-LIHC数据集中对肝炎病毒感染的HCC患者的NAS亚型进行PCA分析。
（B）通过Kaplan-Meier分析比较TCGA-LIHC数据集中C1亚型和C2亚型患者的OS时间。
（C）两种HCC亚型中NAS差异表达基因的火山图，红点表示C2亚型比C1亚型上调的基因；蓝点表示C2亚型比C1亚型下调的基因。
（D）前50个表达改变的NAS基因热图。蓝条代表C1亚型，红条代表C2亚型。
（E）肝炎病毒感染的HCC患者两种亚型中DEGs的GO分析。
（F）肝炎病毒感染的HCC患者两种亚型中DEGs的KEGG分析。
缩写：HCC，肝细胞癌；NAS，核酸感应；PCA，主成分分析；C1，Cluster 1；C2，Cluster 2；OS，总生存率；DEG，差异表达基因。
二、预后核酸感应相关风险评分（NASRS）的构建与验证。
（A）LASSO回归模型在10倍交叉验证中显示的部分似然离差。
(D~H) Kaplan-Meier生存图分别展示5个模型基因的预后价值。
(J、K) 来自TCGA-LIHC训练集和ICGC验证集的高NASRS组和低NASRS组的风险评分分布和生存状况。
（L）Sankey图显示了NAS亚型、NASRS组和生存状况的变化。
缩写：NAS，核酸感应；NASRG，核酸感应相关基因。
三、5个候选基因在单细胞测序和HCC细胞系中的表达水平验证。
（A）肿瘤组织和癌旁组织中5个预后NASRGs的表达差异。
（B）单细胞水平上每种细胞类型在HCC中的百分比。
（C）NASRGs在HCC中各细胞类型中的表达分布。
（D）利用qRT-PCR技术检测NASRGs在L-02细胞、LM-3细胞、Huh-7细胞、HepG2细胞和PLC/PRF/5细胞中的表达。
缩写：HCC，肝细胞癌；NASRG，核酸感应相关基因。
备注：*** P ＜ 0.001；** P ＜ 0.01；* P ＜ 0.05；NS，无显著性。
四、NASRS在HCC患者免疫治疗、靶向治疗和化疗中预测价值的验证。
（A~D) 分别展示了IMvigor210、GSE165252、Nathanson-2017和GSE115821中高NASRS组和低NASRS组对免疫疗法的治疗响应。
（E）在高NASRS组和低NASRS组中预测对8种常见化疗和靶向治疗药物的反应。
缩写：HCC，肝细胞癌；NASRS，核酸感应相关风险评分。
（A、B） Kaplan-Meier生存曲线显示TCGA和ICGC数据集中高NASRS组和低NASRS组之间的OS。
（B、D）森林图显示了临床特征和NASRS对OS的单变量和多变量分析结果。
(E) 列线图预测感染肝炎病毒的HCC患者1年、3年和5年的总生存概率。
(F) 根据提名图、NASSRS、年龄、性别、TNM分期和T分期分别预测1年OS的时间依赖性ROC曲线。
缩写：HCC，肝细胞癌；NASRS，核酸感应相关风险评分；OS，总生存
六、NASRGs模型核心基因-HSP90AA1的鉴定与验证。
（A）维恩图获得NAS亚型DEGs以及病毒相关HCC与癌旁组织DEGs的重叠基因。
（C）通过MNC和Degree方法筛选出的前20个NAS基因。
（C~E） HPA数据集中的免疫组化图片，HSP90AA1在肝癌组织中显著升高（抗体CAB002058）。
（F） TCGA和ICGC数据集中HSP90AA1在原发性肝癌和癌旁组织中的表达。
(G) Kaplan-Meier生存曲线分别显示了TCGA和ICGC数据集中HSP90AA1的预后价值。
(H、I）Ergocryptine和CGP‐57380的三维图。
缩写：DEG，差异表达基因；HCC，肝细胞癌；NAS，核酸感应；NASRG，核酸感应相关基因；PPI，蛋白质-蛋白质相互作用。
七、候选小分子药物（CGP-57380）的抗肿瘤效果检测。
（A~C）使用CCK-8检测法评估治疗后24小时和48小时的细胞活力，并计算IC50值。
（E~G）坏死细胞Annexin-V和PI染色分析，随后用流式细胞术评估。
备注：所有数据均以均数±标准差表示（n = 3）。采用单因素方差分析和多重比较检验计算统计数据：* P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001。
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