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中科生信

2024-01-16

导读：今天小编和大家分析一篇2024年1月发表在《BMC Complementary Medicine and Therapies》（IF:3.9）期刊上的文章

今天小编和大家分析一篇2024年1月发表在《BMC Complementary Medicine and Therapies》（IF:3.9）期刊上的文章《Screening of the key response component groups and mechanism verification of Huangqi-Guizhi-Wuwu-Decoction in treating rheumatoid arthritis based on a novel computational pharmacological model》。类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是滑膜组织和关节软骨的破坏。黄绮桂芝五物汤（Huangqi-Guizhi-Wuwu-Decoction，HGWD）是中药方剂，在治疗RA方面显示出良好的临床疗效。然而，关键反应成分组（key response components group，KRCG）在治疗RA中的协同作用尚未得到充分研究。

背景：

RA是一种常见的慢性炎症性疾病，目前类风湿关节炎的临床治疗包括非甾体抗炎药（NSAIDs）、疾病修饰性抗风湿药（DMARDs）、糖皮质激素和其他生物制剂。然而，这些药物的副作用限制了它们的长期使用。传统中药（Traditional Chinese medicine，TCM）几个世纪以来一直用于治疗复杂疾病，副作用最小。中药配方黄芪桂枝五物汤（HGWD）治疗RA具有显著的抗炎作用。然而，HGWD在RA治疗中的具体成分和作用机制有待进一步研究。HGWD由五种植物成分组成：黄芪、桂枝、芍药、生姜、大枣。这种结合反映了中药配方的特点复杂性，涉及多种成分、途径、环节和目标。中药方剂的复杂性对其药理机制的研究提出了挑战。网络药理学是一门新兴学科，它提供了一种包含中医综合性、系统性、动态性的研究策略，有助于中医药的现代化。相关研究已经表明各种中药方剂在肝癌、骨质疏松症、系统性红斑狼疮和RA等多种疾病中的药理机制。KRCG及其介导的核心功能空间（Core functional space，CFS）是中药配方中与疾病进展密切相关的活性成分和靶点。它们也是在整个处方中发挥疗效的关键部分，也是探索药理机制的关键线索。

在本研究中，我们探讨了HGWD治疗RA的KRCG和CFS，并利用KEGG和GO分析在功能水平上验证了它们的有效性。此外，选择了4种组分进行了体内验证，结果显示了它们能够抑制RA的炎症反应。蛋白印迹实验进一步揭示了它们通过多种途径和靶点的协同效应。

方法：

1，RA相关致病基因的选择和鉴定

2，HGWD 潜在候选成分的鉴定

3，活性成分和靶标分析

4，核心功能空间的构建和有效蛋白的筛选

5，KRCG的确定和验证

6，体外验证 KRCG

研究结果：

（一）RA相关致病基因的选择和鉴定

利用GeneCards和DisGeNET数据库确定RA相关致病基因，共有 844 个共享致病基因被认为与RA相关（图 1A）。为了验证这些致病基因是否与RA高度相关，从数据集GSE55235中提取了这些致病基因的表达矩阵，并进行了热图分析。结果证实，这些致病基因能将RA与健康样本区分开来，并能准确反映 RA发病过程中病理基因的变化（图 1B）。KEGG富集分析显示这些基因富集的通路包括RA通路、NF-κB 通路、TNF通路和破骨细胞分化通路（图 1C）。此外，GO富集分析表明，这些致病基因与各种细胞因子的产生和多种免疫细胞的激活有关（图 1D）。

（二）HGWD 潜在候选成分的鉴定

从在线数据库TCMSP、TCMID、TCM@Taiwan和YaTCM中共收集到927个HGWD中的成分。根据筛选标准，349个潜在候选成分被保留作进一步分析，包括 HQ中的30个、GZ 中的109个、SY中的36个、SJ中的141个和DZ中的33个（图 2A）。此外，我们还提取了HGWD中化学浓度较高且具有生物活性的化合物，并将其与349种可能的候选成分相结合，最终得出了366种候选成分（图 2A）。筛选前和筛选后的性质变化表明，候选成分更符合药物筛选标准，可能具有更好的活性（图 2B）。

（三）活性成分和靶标分析

通过分析这些候选成分在五种药材中的分布，我们发现有 39 种候选成分同时存在于两种或两种以上的药材中（图 3A）。SJ、GZ、SY、DZ 和 HQ 分别含有 110、79、36、31 和 27 种特定候选成分。为了进一步探索潜在的治疗机制，我们预测了这五种草药的靶点。通过整合来自 SEA、HitPick 和 Swiss Target 在线工具的信息，我们得到了 618 个 HQ 靶点、1290 个 GZ 靶点、828 个 SY 靶点、1171 个 SJ 靶点和 957 个 DZ 靶点。分布图显示，323个靶点共存于五种中草药中，其中大多数在RA的进化和干预中起着关键作用（图3B）。HQ、SY、DZ、SJ 和 GZ 分别有 12、43、102、88 和 174 个靶点，这充分反映了中药方剂复杂的多靶点特征和协同治疗机制，可以通过协调共享和独特的成分和靶点来治疗 RA。

（四）核心功能空间的构建和有效蛋白的筛选

为了进一步探索HGWD在RA中的潜在治疗机制，在剔除重复基因后使用1666个靶点构建了成分-靶点网络（C-T网络）。但考虑到C-T网络只能反映部分治疗效果，不能反映治疗效果的传播模式，进一步将致病基因-基因相互作用与C-T网络整合，构建了一个全面的C-T-P网络，在一定程度上揭示了生物体生命活动的复杂调控关系。结果表明，C-T-P 网络包含2495个节点和57683条边。在C-T-P 网络中，节点影响力是最关键的拓扑属性之一。一般认为，影响力得分高于C-T-P网络平均节点影响力得分的节点是关键角色和中心枢纽。根据这一原理，提出了一种新颖的模型，即同时考虑节点控制力和节点桥接力来计算该 C-T-P 网络中节点的影响力，并保留这些大于平均值的节点及其边来构建核心功能空间（CFS），识别出796个有效蛋白质。

为了验证从 CFS 中获得的有效蛋白质能否在功能水平上反映 RA 的特征，进行了KEGG和GO分析，并将其与靶基因和致病基因（T&P 基因）进行了比较。结果显示，在T&P基因中富集的216条KEGG通路和3856个GO术语中，模型覆盖了191条KEGG通路和3109个GO术语，覆盖率分别为88.43%和80.63%（图4A）。这些KEGG通路和GO术语中的大多数都已被详细记录，并与RA密切相关。其中包括 PI3K/AKT、MAPK、TNF 和 NF-kappa B 通路。此外，还将其与其他广泛用于计算节点影响力的模型进行了比较，包括间度中心性、亲近中心性、聚类系数、度和邻接连通性。我们利用每个模型得到的有效蛋白质进行了功能分析，并计算了它们的 KEGG 通路和目标基因及致病基因的 GO 项覆盖率。结果表明，无论是与 T&P 基因相比，还是与靶基因和致病基因相比，我们的模型的 KEGG 通路和 GO 术语覆盖率都高于其他模型（图 4A-B）。总之，我们的模型在功能层面确定具有干预潜力的关键基因方面具有更高的准确性和可靠性。

本研究使用了三个数据集。第一种类型代表直接连接成分靶标和致病基因的基因，我们将其描述为关联基因集。第二类是唯一属于致病基因的基因，我们将其定义为疾病主导基因集。第三类是特异性靶向成分靶点的基因，被确定为成分主导基因组。为了评估 CFS 筛选出的有效蛋白质是否能更好地反映致病基因，我们对这三种类型的蛋白质进行了功能分析。如图 4C 所示，在 KEGG 通路中，关联基因集、疾病主导基因集和组分主导基因集分别占致病基因的 45.32%、53.95% 和 93.52%；而有效蛋白占 95.68%，高于前三种类型。同样，在 GO 分析结果中，关联基因集、疾病主导基因集和成分主导基因集分别占 56.56%、58.39% 和 75.82%，远低于有效蛋白质的 81.22%（图 4C）。这些结果进一步验证了我们构建的模型的可靠性，同时也验证了CFS筛选出的有效蛋白可以代表RA致病基因的功能，并可能在RA的HGWD治疗中发挥重要作用。

（五）KRCG的确定和验证

为了进一步优化活性成分并获得关键反应成分组（KRCG），采用了递增覆盖系数（ICC）模型来评估各成分的累积贡献率。根据累积贡献率得分的输出结果，只有前四种成分，即醋酸苄酯（MID013540）、香草酸（MID009964）、苯甲酸丁酯（MID014553）和毛蕊花酰胺（MID018278）占有效蛋白质的 50.12%。59种成分的677个靶标贡献了85.05%的靶标覆盖率，定义为 KRCG（图 5A）。

为了进一步评估KRCG在功能水平上治疗RA的有效性，提取了由KRCG产生的677个靶点作为关键反应蛋白，并在KEGG通路和GO术语水平上与致病基因和靶基因进行了比较。结果显示，关键反应蛋白富集了192个KEGG通路，分别占致病基因和靶基因的84.89%和87.94%；关键反应蛋白富集了3071个GO术语，分别占致病基因和靶基因的72.17%和82.33%（图 5B）。图 5C 显示了通过 KRCG 富集分析的前 30 条信号通路，主要涉及 cAMP、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抗性、钙信号转导、PI3K-Akt 和 HIF-1 通路。其中，cAMP、PI3K-Akt 和 HIF-1 通路与 RA 的进展或治疗广泛相关。总之，KRCG筛选在功能层面上部分揭示了HGWD治疗RA的潜在机制。

（六）体外验证 KRCG

随机选取了四种成分（毛蕊花酰胺，MID018278；6-巴拉多，MID012414；氢化肉桂酸，MID010180；原儿茶酸，MID007590），从实验层面验证了KRCG 的有效性和筛选模型的可靠性。结果表明，当毛果芸香酰胺的浓度低于25μM、6-巴拉多的浓度低于12.5μM、氢化肉桂酸的浓度低于200μM、原儿茶酸的浓度低于200μM时，四种成分对RAW 264.7细胞没有明显的细胞毒性。因此，在随后的实验中使用了这些无细胞毒性作用的浓度范围。RA 的发病机制通常表现为白细胞介素6（IL-6）、Nos2、一氧化氮（NO）和其他炎症因子的增加以及MAPK和NF-κB通路的激活。因此，测定了一氧化氮的产生水平，结果显示LPS 模型组比对照组增加了4.2倍，表明LPS成功地引发了RAW264.7细胞的炎症反应。然而，当使用毛果芸香酰胺（6.25、12.5和25μM）、6-巴拉多（3.125、6.25和12.5μM）、氢化肉桂酸（50、100和200μM）和原儿茶酸（50、100和200μM）处理时，NO的释放以浓度依赖的方式显著减少（图 6A），这表明这四种成分具有抗炎作用。为了进一步验证它们的抗炎作用，测量了细胞内Nos2和IL-6的水平，它们是炎症反应的典型标志物。如图 6B 和 6C 所示，在 LPS 模型组中，Nos2 和 IL-6 的水平明显升高，而在给药组中，它们的水平以剂量依赖的方式降低（图 6B-C）。总之，研究结果表明，四种成分都能有效抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞炎症反应，进一步证实了 KRCG 的有效性。

【声明】内容源于网络

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