背景
方法
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TCGA数据库数据用于分析CRC患者的转录组数据和临床信息（TCGA-COAD）。我们的数据是从TCGA数据库获得的，包括445名结肠癌患者的RNA-seq。GEO数据库用于获取CRC患者的单细胞测序数据（GSE146771，GSE139555）。GSE139555研究检查了从14名癌症患者的肿瘤、邻近组织和外周血采集的治疗前样本的单细胞TCR-seq和单细胞RNA-seq数据。此外，多种癌症的外部独立免疫治疗数据集（GSE126044、GSE135222、GSE91061和GSE111636）被用作验证。 -
获得验证队列的过程如下：从广西医科大学附属肿瘤医院的18名未经放化疗的结肠癌患者中获取新鲜结肠癌组织和正常组织（距离癌组织10-15cm）进行转录组测序。所有方法均按照相关指南和规定进行，并经广西医科大学附属肿瘤医院伦理审查委员会（LW2023077）批准。患者提供了参与本研究的书面知情同意书。 -
结肠癌细胞（SW480和RKO）购自细胞库（中国上海生物化学与细胞生物学研究所），并在10%FBS + DMEM中培养。从锐博生物广州（中国）购买了用于SLC2A3的siRNA，以及阴性对照NC。它遵循以下序列if-SLC2A3：GTAGCTAAGTCGGTTGAAA。按照制造商的说明，使用Lipofectamine3000试剂（Thermo Fisher Scientific）进行siRNA转染。 -
根据制造商的说明，使用CCK-8（Cell Counting Kit-8，Dojindo Molecular Technologies，熊本）测定细胞活力，然后接种到96孔板中。然后，向每个孔中加入10μL CCK8试剂，并在37°C下孵育1小时。使用Benchmark酶标仪（BioTek Instrument，，Winooski，VT，United States）在24、48和72小时测量450nm处的吸光度值。 -
使用来自Beyotime（中国上海）的RIPA缓冲液从细胞中提取蛋白质。 -
肿瘤的单细胞数据库称为肿瘤免疫单细胞中心（TISCH），使用TISCH作为数据库，从CRC患者的单细胞数据中提取了NK细胞相关基因。limma 包用于筛选COAD和正常结肠样本的mRNA表达。 -
通过使用单因素Cox回归，分析了NKGs与CRC患者OS的显著差异。对这些NKGs进行LASSO回归分析，以确定更显著的预后因素。基于两个与OS显著相关的NKG，使用中位风险评分将患者分为高风险和低风险亚组。ROC曲线用于测试模型的准确性。此外，使用GSE39582验证队列对模型进行验证。 -
检查了临床特征是否是独立的预后因素。进行了一项多变量独立预后和基于Cox回归的单变量研究。通过采用NKG表达模式和主成分分析。 -
我们使用“GSVA”R软件包来分析GSVA富集数据，以比较高风险和低风险的生物过程。使用MSigDB基因集（cp.kegg.v7.2.symbols.gmt进行基因符号注释。比较低RS和高RS亚组，使用ssGSEA 算法通过差异免疫细胞浸润和功能性免疫富集进行量化。 -
UALCAN 是一种组学数据分析网络服务，可为癌症提供全面的组学数据分析。对关键基因进行UALCAN分析以确定其蛋白质表达水平。TIMER是一个快速的Web应用程序，用于分析全球各种癌症类型的免疫浸润。基于TIMER算法，基因表达与免疫浸润相关,采用TIMER算法预测基因表达与免疫浸润的相关性。 -
癌症免疫组数据库（TCIA）提供了来自TCGA和其他数据源的20种实体癌的二代测序数据（NGS）数据的综合免疫基因组分析结果。根据TCIA中CRC患者的数据计算免疫外观评分（IPS），以预测患者对免疫治疗的反应。然后，采用了肿瘤免疫功能障碍和排除（TIDE）预测高NKRS和低NKRS亚型的免疫反应。此外，从GEO数据库中获得了不同类型癌症的免疫治疗数据集，并进一步验证了NKRS的预测价值。
结果
1.GEO数据的单细胞分析使我们能够可视化CRC细胞的重要亚群并鉴定了NK细胞相关调控基因（NKGs）。将两个单细胞数据确定的NKG进一步合并，重叠的基因为NKGs。Metascape进行的功能富集分析发现，NKGs主要富集于体液免疫应答、免疫调节、白细胞活化调节、白细胞活化、适应性免疫应答、免疫系统细胞因子信号传导和VEGFA-VEGFR2信号通。
2.首先在TCGA-COAD数据集中进行差异基因分析，并进一步筛选出显着不同的NKGs。然后使用结直肠癌的预后数据构建预后模型，并生成NK风险评分（NKRS）。使用中位RS值划分高风险和低风险亚组。PCA分析结果显示，RS可以更好地将患者分为两种不同的亚型。此外，发现高RS组患者的预后较差，死亡率较高（25%）。受时间影响的ROC曲线，评估预后模型对CRC患者的预测能力。。为了进一步验证NKGs模型的准确性，从GEO数据库下载了mRNA表达矩阵（GSE39582）用作验证队列。TCGA-COAD研究结果证实，与低RS亚组患者相比，高RS亚组患者的预后更差，死亡率更高。
3.使用来自TCGA-COAD的mRNA和蛋白质表达谱数据研究基因表达水平。结果显示，mRNA和蛋白在肿瘤组织中SLC2A3的表达水平显著升高，而POU2F2的表达水平在肿瘤组织中显著降低。TIMER Web 服务器用于评估 SLC2A3 和 POU2F2 与 NK 细胞的关联，结果显示，这两个基因均与NK细胞呈正相关。
4.为了进一步验证NKRS的作用，我们首先通过单因素和多因素COX分析了RS是否是CRC患者的独立预后因素。结果显示，RS是TCGA-CRC队列和GSE39582队列的独立预后因素。GSEA富集分析进一步揭示了高RS和低RS亚组之间的富集途径，结果明确了细胞粘附分子、趋化因子信号通路、细胞因子受体相互作用、黏着斑和系统性红斑狼疮主要富集在高RS组，以及抗坏血酸代谢、丁酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、过氧化物酶体、和核糖体主要富集于低RS组。这些发现为RS的进一步研究和临床应用提供了价值。
5.为了进一步验证研究结果，首先从广西医科大学附属肿瘤医院收集了18例未经放化疗的结肠癌患者的新鲜结肠癌组织和正常组织。实验结果与上述分析结果一致，SLC2A3在肿瘤组织中的mRNA表达水平显著升高，而POU2F2在肿瘤组织中的mRNA表达水平显著降低。此外，我们根据患者的表达水平将患者分为高RS亚组和低 RS亚组，发现低RS亚组无患者发生转移，高RS亚组均有转移患者出现，因此推测这也可能是RS高患者预后较差的原因之一。
6.作为对NKRS临床相关性的进一步研究，我们利用ssGSEA算法分别研究了具有最高和最低免疫细胞群的高RS和低RS亚组的比例。在高危人群中，与免疫相关的功能通路显著富集，如II型-IFN反应、I型-IFN反应、T细胞共刺激、T细胞共抑制、副炎症、炎症促进、CCR、MHC-I类、APC共刺激、溶细胞活性、HLA、检查点、APC共抑制。另一方面，免疫细胞的分布更为复杂，其中静息的NK细胞、巨噬细胞M2、巨噬细胞M1、巨噬细胞M0和活化的肥大细胞在高危人群中明显更常见，而浆细胞、T细胞CD4记忆静息、T细胞调节和低危群活化的NK细胞显著富集。IPS用于预测患者对免疫治疗的反应。根据研究结果，低RS组的敏感性高于高RS组。
7.在结直肠癌患者中，我们发现低NKRS组患者对免疫治疗更敏感。为了进一步研究NKRS在免疫治疗中的作用，我们应用了四个外部独立的免疫治疗队列来评估NKRS在预测免疫治疗反应方面的机制。在所有四个不同队列中，对免疫治疗有反应的患者的NKRS较低，结果表明，低NKRS患者可能更适合免疫治疗。
8.基于已发表的TCGA-CRC患者数据，单因素和多因素Cox分析结果表明， SLC2A3高表达可能预示着预后不良。为了进一步研究SLC2A3在CRC中的潜在生物学功能，我们通过siRNA敲低SLC2A3。结果显示，敲低SLC2A3后，CRC细胞增殖率显著降低，CRC细胞凋亡增加。此外，生物信息学分析结果显示，SLC2A3与TGF-β信号通路显著相关。TGF-β信号通路的异常激活通常与肿瘤的恶性表型有关。Western blot结果显示，当SLC2A3被敲低时，TGF-β信号通路中关键蛋白的表达水平受到显著抑制，异常表达的SLC2A3可能通过TGFβ信号通路维持CRC细胞的恶性增殖能力。
