大家好！今天小编和大家分享一篇24年发表在Journal of Ovarian Research（IF:4.234）杂志的文章《Mechanisms of Bushen Tiaoxue Granules against controlled ovarian hyperstimulation-induced abnormal morphology of endometrium based on network pharmacology》。作者通过GEO数据库和网络药理学分析卵巢过度刺激致子宫内膜异常中补肾调血颗粒相关靶点，进一步探索卵巢过度刺激对子宫内膜形态恶性影响的新机制。
背景：
体外受精和胚胎移植（In vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）作为辅助生殖技术的主要干预手段，已被越来越多的不孕夫妇所选择。有系统综述显示，IVF-ET的累计活产率在56 ~ 65%之间，失败的主要原因是IVF期控制性卵巢过度刺激（controlled ovarian hyperstimulation，COH）引起的卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）。COH主要通过产生过量的促性腺激素来干扰胚胎着床过程，包括内源激素水平、受精卵质量、子宫内膜容受性等影响生殖结局。研究表明，子宫内膜仅在一个狭窄的窗口内可接受。在人类中，子宫内膜容受性在排卵后7-10天达到最大值，而在大鼠中，它在交媾后大约4天发生。在囊胚着床过程中，子宫内膜的形态和功能发生动态变化。虽然COH是获得高质量和更多卵泡的重要方法，但它导致子宫内膜容受性建立与着床窗口同步不平衡，这一点需要强调。
已有许多研究来寻找治疗改善子宫内膜状态。然而，根据目前的数据，只有宫腔镜和输卵管积水治疗被证实对改善生育结果显著有效，并被纳入标准治疗。子宫内膜损伤可诱导无菌炎症，调节子宫内膜免疫状态，促进去个体化。考虑到子宫内膜血流量减少会对妊娠和活产结局产生不利影响，临床上应用一些增加子宫动脉血流量或扩张血管的药物，如阿司匹林、肝素、维生素E等。也有研究表明，宫内给药，包括人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HGG）、外周血单核细胞、富血小板血浆等，可通过诱导子宫内膜分化和着床窗口，提高妊娠率和活产率，但这些研究大多无显著差异。研究发现，目前的治疗似乎侧重于改变子宫内膜的某种形态或功能，但未能从整体上调节子宫内膜环境。改善子宫内膜容受性的多靶点、多通路策略值得探索。
在妇科及生殖相关疾病领域，如多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症等，中医药（traditional Chinese medicine，TCM）因其疗效越来越受到重视。补肾调血颗粒（Bushen Tiaoxue Granules，BTG）是一种含有12种中草药的复方中草药，在临床和动物实验中被证明是有益的。在中医理论中，妇科病是以血为本的。由于月经周期和生理条件的原因，血虚是女性疾病的一大特点。同时，肾脏储存“精”，这是女性怀孕和滋养胎儿的关键。缺乏“精”会导致子宫成熟失败。因此，补肾调血是中医治疗妇科不孕症的一大原则，BTG就是遵循这一原则。在156例受试者随机对照试验中，52例接受冻融胚胎移植的患者给予BTG。治疗3个月后，BTG组子宫血流分布优于对照组。我们前期的实验研究发现，BTG可以提高子宫内膜血管生成能力，这可能与COH诱导大鼠雌激素受体和孕激素受体上调有关。此外，给药BTG后，产子率和子宫内膜容受性指标如白血病抑制因子和血管内皮生长因子A均升高。然而，BTG的作用机制尚未完全阐明。网络药理学的应用模式与中医的整体理念是一致的。它使用综合生物信息学分析来预测关键分子和途径，并通过体内或体外实验验证结果是必要的。
本文采用网络药理学数据库和UPLC-MS相结合的方法进行了成分预测。采用分子对接技术进行初步筛选。最终，为了进一步确认BTG的关键靶点，我们进行了体内实验，进一步探索BTG保留COH对子宫内膜形态恶性影响的新机制。
方法：
1.BTG的成分分析及筛选；
2.BTG靶点及疾病相关基因的预测；
3.PPI和功能富集分析；
4.分子对接验证；
5.BTG改善COH大鼠着床期间子宫内膜形态；
6.BTG逆转了FOXO1A、β-catenin和COX-2蛋白表达的下降；
7.D-Gal及BTG中潜在活性成分对HESCs的细胞毒性；
8.5种潜在化合物对D-Gal诱导hESC损伤的保护作用。
研究结果：
1.BTG的成分分析及筛选
通过UPLC-MS的正、负模式，检测到上千种成分。为了提高本研究的针对性和准确性，分别在中药系统药理学（Traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）据库中对BTG中所含的12种中药成分进行了检索。利用口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和药物相似性（drug-likeness，DL）和现有文献共确认了141个化学成分，其中只有9个与UPLC-MS/MS结果吻合(图1)。
2.BTG靶点及疾病相关基因的预测
将BTG的9种有效成分输入TCMSP和SwissTargetPrediction平台，得到推定靶标，共收集到165个靶标(图2A)。此外，我们还利用HERB获得了一个单一的草药相关靶点。与9个分量的目标进行交叉，边数最小值设为2，得到18个目标(图2B)。使用GEO数据库（GSE92324、GSE107914和GSE165004）筛选与COH后子宫内膜容受障碍相关的基因（筛选标准：log2fold-change（FC）|>3和P＜0.05）。随后，通过将这些靶点与预测的BTG潜在靶点相交，发现了6个基因（PTGS1、PTGS2、THBD、GJA1、DUOX2和XDH）(图2C)。然而，韦地内酯和雌三醇并未被认为与这6个基因相关，我们对BTG的7个潜在成分及其对应的靶标进行了网络关联图(图2D)。
3.PPI和功能富集分析
构建了76个直接或间接潜在靶点的PPI网络，CTNNB1、TP53、EGFR、SRC、CDH1、HSP90AA1和MDM2是PPI构建的核心基因(图3A)。MCODE分析主要将PPI分为四个功能相似的类。在排除癌症相关途径等异质富集方式后，剩下的簇与粘附连接、FoxO信号通路、生长激素合成、分泌和作用、花生四烯酸代谢有关(图3B)。随后，我们对76个靶点进行了GO和KEGG通路富集分析(图4)。GO分析包括生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)。BTG对逆转COH的改善作用主要集中在细胞对氮化合物的反应、调节细胞对应激的反应和蛋白质分解代谢过程。KEGG通路富集分析显示BTG调控粘附连接、花生四烯酸代谢、补体和凝血级联等
4.分子对接验证
筛选出PPI网络中度较高的靶点，与7个潜在靶点进行分子对接分析。从PDB数据库中检索到靶点的晶体结构，通过x射线衍射、核磁共振或3D电镜重建确定CTNNB1 (1LUJ)、TP53 (6SL6)、EGFR (1M17)、SRC (1FMK)、CDH1 (3FF7)、HSP90AA1 (1BYQ)、MDM2 (6KZU)、EP300 (3BIY)、STAT3 (5AX3)、ERBB2 (2A91)、GSK3B (109u)、CREBBP (6YIL)和PTGS2 (5F1A)。CAV1的构象未通过实验确定，采用AlphaFold预测的结构(AF-Q03135)。将亲和度作为对接强度的标志，各亲和力均小于-5.8 kcal/mol，平均值为-7.75 kcal/mol(图5A)。此外，选择4个组合良好的图案进行可视化，如图5B所示。
5.BTG改善COH大鼠着床期间子宫内膜形态
实验方案如图6A所示。在建模之前，首先确认了发情周期。图6B显示了四个周期的典型特征。与对照组相比，COH大鼠的新鲜子宫明显水肿(图6C)。然后行HE染色评价子宫内膜形态。图6C显示，对照组大鼠子宫内膜上皮细胞排列有序，间质中成纤维细胞去个别化。而COH大鼠子宫上皮细胞排列疏松，细胞水肿明显，间质细胞蜕膜不明显，影响胚胎着床。BTG可逆转上皮细胞疏松和水肿结构，增强分泌活性，丰富血管，最终改善子宫内膜功能障碍。
6.BTG逆转了FOXO1A、β-catenin和COX-2蛋白表达的下降
通过免疫组化和western blot验证蛋白表达水平的差异。图7A显示，FOXO1A在三组大鼠子宫内膜腔上皮和腺上皮中均有表达。COH后，FOXO1A的表达降低，但随着BTG的增加而升高。β -连环蛋白分布在细胞膜和细胞质中，COH后其在细胞顶端的表达明显。BTG使其表达增加(图7B)。三组子宫内膜COX-2表达均不明显，但BTG使COH大鼠的COX-2表达呈下降趋势(图7C)。为了弥补IHC定量可行性的不足，采用western blot方法对这三种蛋白的表达进行定量。与对照组比较，模型组小鼠FOXO1A (p＜0.05)、β-catenin (p＜0.01)、COX-2 (p＜0.01)的表达均降低。BTG增加了COH后大鼠FOXO1A (p＜0.05)、β-catenin (p＜0.01)和COX-2 (p＜0.05)的表达(图8)。
7.D-Gal及BTG中潜在活性成分对HESCs的细胞毒性
先前的研究发现，COH后子宫内膜基质细胞的衰老表型增加，这不利于胚胎着床期间的脱胞化。D-Gal是一种被广泛认可的引起氧化应激损伤和促进衰老的模拟剂。结果表明，200 mM的D-Gal诱导hESCs细胞增殖抑制近50%(图9A)。随后，根据质谱分析和分子对接结果，选择槲皮素、杉木素、山奈酚、周己醇和异鼠李素，进一步探索其对生育的保护作用。根据已有文献对每种化合物设置6个浓度梯度：槲皮素浓度为0.1 μM、1 μM、10 μM、20 μM、40 μM、80 μM；杉木素、山奈酚、周己醇和异鼠李素浓度分别为15.625 μM、31.25 μM、62.5 μM、125 μM、250 μM和500 μM。如图9B-F所示，即使在500 μM的浓度下，异鼠李素对hESC增殖的抑制也未能达到50%。IC50测定值为：槲皮素，45.35 μM；紫杉醇，263.1 μM；山奈酚，398.9 μM；周期醇，233.2 μM。这些发现表明这些潜在的天然产物对hESCs表现出有限的细胞毒性。
8.5种潜在化合物对D-Gal诱导hESC损伤的保护作用
在D-Gal干预24小时后，分别给予两种不同浓度的槲皮素(50 μM和25 μM)、杉木素(260 μM和130 μM)、山奈酚(400 μM和200 μM)、周周醇(230 μM和115 μM)和异鼠李素(500 μM和250 μM) 24小时。采用CCK-8法评估细胞活力(图10A)。结果表明，槲皮素和异鼠李素都不能有效改善D-Gal的有害影响。然而，两种浓度的山奈酚、环二醇和杉木素都能有效改善D-Gal在hESC中引起的细胞活力损伤(图10B-F)。
