黑色素瘤免疫原性细胞死亡的综合特征揭示了与预后和肿瘤免疫微环境的关系- 大数跨境

中科生信

2023-10-05

导读：大家晚上好！今天小编和大家一起分享一篇2022年9月发表在Frontiers in Immunology杂志

大家晚上好！今天小编和大家一起分享一篇2022年9月发表在Frontiers in Immunology杂志（IF: 7.3）的文章《Comprehensive characterisation of immunogenic cell death in melanoma revealing the association with prognosis and tumor immune microenvironment》。黑色素瘤免疫原性细胞死亡的综合特征揭示了与预后和肿瘤免疫微环境的关系。

背景

最严重的皮肤癌类型是黑色素瘤，它是由黑色素细胞的恶性肿瘤引起的。诊断较晚导致黑色素瘤预后不良。尽管手术切除，免疫疗法，基因疗法等典型疗法广泛用于黑色素瘤患者，但黑色素瘤的死亡率在过去几十年中稳步上升，这导致了公共卫生问题。因此，需要提出灵敏的方法来准确评估黑色素瘤患者的临床结果，以促进精准医学的发展。

近年来，大多数免疫系统成分被认为与黑色素瘤的发生和发展有关。目前，作为免疫治疗药物实例的PD-1、PD-L1和CTLA-4抑制剂被应用于黑色素瘤。然而，这些治疗仅在少数患者中有效，大量患者对治疗的反应有限或不存在，特别是在黑素瘤发展时。因此，为了研究免疫和免疫相关指标的潜在预测作用，需要对免疫和黑色素瘤之间的关系进行广泛的研究。

细胞死亡命名委员会（NCCD）在过去十年中从形态学，生化和功能角度制定了定义和解释细胞死亡的建议。免疫原性细胞死亡（ICD）是由多种抗癌治疗方式（如放疗和化疗药物）产生的一种独特的细胞死亡。在免疫功能正常的宿主中，它需要激活免疫系统对抗恶性肿瘤。

ICD之后是与损伤相关的各种分子模式的暴露和产生，这些分子模式通过促进抗原呈递细胞的募集和激活，为垂死的癌细胞提供了强有力的佐剂作用。通过诱导ICD改善肿瘤细胞的免疫原性是改善癌症免疫治疗的关键策略。然而，利用ICD治疗黑色素瘤的可能性和机制仍然没有得到很好的研究。

本研究基于ICD相关基因鉴定了黑色素瘤中预后和免疫环境不同的两种亚型，并利用两种黑色素瘤亚型之间的差异表达基因（DEGs）创建了ICD依赖性风险特征（ICDRS）。此外，还进一步分析了特征、预后和免疫之间的关系。研究结果表明，一种新的ICDRS可能被用作黑色素瘤预后预测和免疫环境评估的有用标志物。

方法

1.分子签名数据库（MSigDB）接收的'c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt'文件用于鉴定免疫相关途径基因（MSigDB）

2.将TCGA和GEO的杂交基因表达数据转换为log2（x + 1）形式，通过 “sva” R包进行“ComBat”功能进行批量归一化

3. ssGSEA计算每种癌症每个样本的ICD评分

4. NMF” R包收集TCGA数据集中ICD相关基因的mRNA表达基质进行非负基质分解（NMF）聚类

5.Kaplan-Meier分析不同亚型中疾病特异性生存期（DSS），总生存期（OS）和无进展间隔（PFI）的差异

6.LASSO回归分析和多因素Cox回归

7.Wilcox检验对低危和高风险亚群间ICGs和ICD相关基因的不同表达进行分析

8. CIBERSORT算法计算每个黑色素瘤样品中43个免疫细胞的浸润组成后

9. Pearson相关分析用于说明基于ICDRS的风险评分与免疫相关指标之间的关系

10.下载TCGA中黑色素瘤样本的免疫表谱（IPS）。使用wilcox检验比较来自TCGA的三个队列中低风险和高风险亚群之间的IPS

11.CMap数据库（https://clue.io/COMMAND）预测高表达DEG的潜在药物。

结果

1.数据处理

图1显示了一个总结研究过程的流程图。该分析包括来自TCGA数据库的472个黑素瘤样本和来自GEO数据库的另外214个黑素瘤样本(GSE65904)。在TCGA和GEO数据集的所有基因相交后，总共发现了20，188个共同基因。值得注意的是，37个TCGA黑素瘤样本和4个GEO黑素瘤样本被省略，因为它们的存活数据不完整。总共分别合并了435个TCGA黑素瘤样品和210个GEO黑素瘤样品的mRNA表达数据和存活数据。在接下来的研究中，包括了34个ICD相关基因。

2.ICD相关基因mRNA在不同癌症类型中的表达及其预后意义

首先，图2A显示了ICD相关基因的mRNA表达水平。在热图中，IFNG在CESC、KIRC和GBM中表达明显升高。IFNB1在BRCA和BLCA的表达明显升高，而IL6在BRCA和BLCA的表达明显降低。为了更生动地证明mRNA表达水平差异的重要性，构建了显示-lg (pValue)的热图。相应肿瘤的mRNA表达变化越强烈，颜色越红。(图2B)。mRNA表达和OS之间的单变量cox回归分析的结果区分了风险性ICD相关基因(HR>1，p<0.05)和保护性ICD相关基因(HR<1，p<0.05)。值得注意的是，CD4、FOXP3、CD8A、CXCR3、IFNG、PRF1、MYD88、ATG5、CD8B、IL1R1、TLR4、PIK3CA、TNF、CASP8和EIF2AK3在SKCM表现出保护功能(图2C)。

3.SNV CNV，不同类型癌症中ICD相关基因的甲基化和受ICD相关基因影响的免疫相关通路

CNV、SNV和甲基化存在于各种癌症中。泛癌CNV的总结表明，CNV在各种癌症中以高频率(> 5%)发生(图2D)。SNV国家的ICD相关基因在UCEC很明显也很吸引人。PIK3CA在BRCA、COAD和UCEC显示出较高的SNV。UCEC中PIK3CA SNV突变频率达到近50%(图2E)。确切地说，PIK3CA的SNV类型主要是错义突变(图2F)。值得注意的是，PIK3CA甲基化在大多数癌症中没有意义(图2G)。事实上，ICD相关基因可能与许多免疫相关途径相关，如图2H所示。

4.两种黑色素瘤亚型的NMF聚类识别

根据ICD相关基因的表达矩阵，进行NMF聚类，选出最佳聚类数为2(图3A)。cluster1和cluster2之间临床特征的组成差异表明，这两种亚型在许多方面存在统计学差异，如生存状态、癌症状态和肿瘤分期(图3B)。至于两个群组中不同的生存状态，群组2中的样本具有更好的DSS、OS和PFI(图3C–E)。

肿瘤免疫微环境也有统计学差异。C2存在较高的免疫分，与免疫成分相关。C2的肿瘤纯度比C1差(图3F)。值得注意的是，不同亚型的肿瘤浸润性免疫细胞显示不同的百分比。C2体内有更多的抗肿瘤免疫细胞，如CD8 T细胞、活化的CD4 T记忆细胞、活化的NK细胞和M1巨噬细胞。至于促癌免疫细胞，M2巨噬细胞在C2下调(图3G)。ICG也显示了两个聚类亚型的差异。几乎所有的ICG在C2都有较高的表达。值得注意的是，包括PD-1(PDCD1)、PD-L1(CD274)和CTLA4在内的常见免疫治疗靶点在C2高度表达(图3H)。

5.ICD-DEGs的研究与ICDRS的构建

进行PCA和T-SNE来确定黑色素瘤样本在低风险和高风险亚人群中的总体分布。这两个亚群中的患者可以有效区分(图4A，B)。生存分析表明，两个亚群中的样本对应于不同的生存状态：高风险亚群中的OS率较低(p < 0.05)(图4C)。然后这三种ICD-DEGs在ICDRS中的表达水平通过热图展示：与低风险亚群相比，GBP2和APOBEC3G在高风险亚群中的表达水平较低，而THBS4在高风险亚群中的表达水平较高(图4D)。此外，肿瘤免疫微环境在低风险和高风险亚群中也有统计学差异：与低风险患者相比，高风险患者的免疫评分水平降低，但肿瘤纯度水平增加(图4E，F)；此外，免疫评分与风险评分呈高度负相关(R=-0.52，P=2.8e-16)，而肿瘤纯度与风险评分呈中度正相关(R=0.39，P=2.5e-09)(图4G、H)。此外，对于0.5年、1年和2年生存率，ROC曲线的曲线下面积(AUC)值分别为0.922、0.763和0.696(图4I)。

6.黑色素瘤ICDRS的内部和外部验证

首先，根据训练队列的中位风险评分作为统一基准，将三个测试队列中的患者分别分组为低风险和高风险亚人群。对于内部验证(试验1和试验2群组)和外部验证(试验3群组)，使用T-SNE和PCA可以很容易地将两个亚群中的患者相互区分开来(图5A、5b、6A、5b、7A、7b)。类似地，在三个试验队列中，高危亚人群中的患者经历了较差的OS(均p < 0.05)(图5C、6C和7C)。此外，从三个测试队列中获得的热图证明了GBP2和APOBEC3G的表达减弱，而THBS4在高危亚群中的表达增强(图5D、6D和7D)。同样，这三个队列中的肿瘤免疫微环境具有统计学差异，这与训练队列中的结果相同(图5E、F、6E、F和7E、F)。此外，在试验1队列(R=-0.4，p=1.2e-09)、试验2队列(R=-0.43，p<2.2e-16)和试验3队列(R=-0.6，p<2.2e-16)(图5G、6G和7G)中，免疫评分也与风险评分呈显著负相关，而肿瘤纯度也与试验1队列(R=0.25，p=0.00026)、试验2队列(p = 0.00026)中的风险评分呈显著正相关至于风险评分的诊断价值，对于0.5年、1年和2年生存率，ROC曲线的AUC值在test1队列中分别为0.768、0.767和0.673，在test2队列中分别为0.852、0.762和0.684，在test3队列中分别为0.729、0.706和0.730(图5I、6I和7I)。值得注意的是，内部验证(test1和test2队列)和外部验证(test3队列)中的所有结果与train队列中的结果一致。

此外，同时考虑基于ICDRS的生存概率差异、AUC值和C指数，ICDRS在预后价值和诊断准确性方面优于其他三种信号(图8)。根据AUC，ICDRS在所有四个队列中均表现出令人满意且稳定的表现。值得注意的是，由另外三个特征区分的不同风险亚人群中的生存概率的差异有时没有统计学意义。ICDRS的C指数高于其他三个签名，在四个不同的队列中分别为0.66、0.62、0.64和0.67。

7.所有四个队列中基于ICDRS的免疫相关差异

鉴于肿瘤免疫微环境在低风险和高风险亚人群中的差异，后续研究对所有四个队列的免疫相关差异进行了更深入的探索。首先，四个队列中低风险和高风险亚群中肿瘤浸润性免疫细胞的一致性差异表明，在高风险亚群中，M1巨噬细胞和活化的CD4+ T记忆细胞的浸润丰度较低，但M2巨噬细胞和静息CD4+ T记忆细胞的浸润较多(图9A-D)。随后，Pearson相关分析显示，在训练队列(R=-0.3，p=0.0037)、测试1队列(R=-0.22，p=0.021)、测试2队列(R=-0.23，p=0.0016)和测试3队列(R=-0.31，p=0.00041)中，M1巨噬细胞的比例与风险评分呈显著的负相关(图9E)；在训练队列(R=0.37，p=0.00026)、测试1队列(R=0.35，p=0.00016)、测试2队列(R=0.35，p=5.9e-07)和测试3队列(R=0.56，p=2.2e-11)中，M2巨噬细胞百分比与风险评分呈显著正相关(图9F)；在训练组(R=-0.38，p=0.00018)、测试1组(R=-0.3，p=0.0014)、测试2组(R=-0.29，p=4.4e-05)和测试3组(R=-0.36，p=4.6e-05)中，活化的CD4+ T记忆细胞的比例与风险评分呈显著的负相关(图9G)；静止CD4+ T记忆细胞的百分比与训练队列(R=0.3，p=0.0029)、测试1队列(R=0.26，p=0.0048)、测试2队列(R=0.24，p=0.00082)和测试3队列(R=0.25，p=0.0049)中的风险评分呈显著正相关(图9H)。

此外，四个队列中低风险和高风险亚型中ICG表达的差异表明，共有52个ICG在高风险亚群中表达下降(图10A-D)。是30个ICG(HLA-A、BTLA、CD80、HLA-C、CD27、CD40、CD86、BTN3A1、HLA-DMB、CD96、HAVCR2、HLA-B、HLA-DMA、ICOS、HLA-DOB、LGALS9、PDCD1、HLA-DPB1、HLA-F、HLA-DOA、HLA-DRA、HLA-E、HLA-DQA1、IDO1、KIR2DL4、LAG3、PDCD1LG2、HLA。

其次，ICD相关基因在低风险和高风险人群中也有差异。在所有四个队列中，共有17种ICD相关基因(ATG5、CASP1、CASP8、CD4、CD8A、CD8B、CXCR3、ENTPD1、IFNG、IFNGR1、IL1B、LY96、MYD88、NLRP3、PRF1、TLR4、TNF)在高危亚人群中的表达同时降低(图11A)。此外，在低风险和高风险亚群中，每个免疫相关途径的激活是不同的。高危亚型的特点是免疫相关途径的激活减少。在四个队列的两个亚群中，有21条途径同时显示出统计学差异(图11B)。值得注意的是，6种ICD相关基因(CD8A、PRF1、IFNG、CXCR3、TNF、CD8B)在四个队列中始终与风险评分呈中度负相关(所有R<-0.3，所有p<0.05)(图11C-F)。21种具有统计学差异的免疫相关途径中的20种(如MHC类和II类介导的抗原呈递和加工、Toll样和NOD样受体信号传导途径、T细胞和B细胞受体信号传导途径、NK细胞介导的细胞毒性、IL-1、IL-2和IL-10相关的信号传导途径、PD-1和CTLA-4相关的途径)与四个队列中的风险评分呈中度负相关(所有R均<-0.3，所有p均< 0.05)(图11G-J)。

8.基于ICDRS预测黑色素瘤的免疫治疗反应和潜在药物

最近的研究表明，基于免疫原性的IPS有助于免疫治疗反应的预测。分析在不同ICDRS亚群中使用抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体的应答概率。这表明高风险亚细胞具有较低的IPS，并且可能具有较差的免疫治疗反应(图12A-C)。在所有四个队列中，筛选标准分别为FDR < 0.05和log2 FC > 1，探索高危人群中上调的目标DEGs。鉴于四个队列中潜在药物的各自预测，作用于上调的目标deg的31种药物如下:阿西替尼、布里瓦尼、塞地拉尼、华蟾素、达沙替尼、多维替尼、ENMD-2076、GTP-14564、HG-6-64-01、伊马替尼、林尼替尼、马西替尼、米多司桃林、莫替沙尼、尼罗替尼、奥利司他、哇巴因、帕唑帕尼、保泰松、PD-1733作用机制如图12D–G所示。

主要结论

我们基于ICD相关基因的表达成功地将TCGA黑色素瘤样本分为两种亚型，并基于两种亚型之间的DEGs开发了一种涉及3种基因(即GBP2、THBS4和APOBEC3G)的预后性ICDRS。ICDRS在训练队列、内部验证队列(test1和test2队列)和外部验证队列(test3队列)中表现出良好的诊断价值并与不同的肿瘤免疫微环境相关。因此，基于三个ICD相关差异基因表达的ICDRS可用于确定预后、M1/M2巨噬细胞的浸润、ICGs和ICD相关基因的表达水平，以及黑色素瘤中免疫相关途径的功能。这将有助于患者分类，以便进行量身定制的黑色素瘤治疗。

【声明】内容源于网络

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