6+！膳食核苷酸通过影响肠道菌群组成和代谢功能促进新生大鼠微生物-肠-脑轴发育- 大数跨境

中科生信

2023-11-30

导读：大家晚上好！今天小编和大家分享一篇23年11月发表在JOURNAL OF AGRICULTURAL AND

大家晚上好！今天小编和大家分享一篇23年11月发表在JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY（IF:6.1）杂志的文章《Dietary Nucleotides Promote Neonatal Rat Microbiota–Gut–Brain Axis Development by Affecting Gut Microbiota Composition and Metabolic Function》。本研究表明早期摄入膳食核苷酸（dietarynucleotides，NTs）促进并增加了与新生儿神经发育、消化和肠道吸收有关的有益微生物的丰度，如g_Romboutsia和g_Akkermansia。揭示了特征代谢物与神经发育和特征肠道微生物群成分之间的显著相关性。表明牛奶中NTs可能通过调节肠道微生物群-肠-脑轴影响生命早期的神经发育和成熟。

背景

NTs是乳汁中主要的非蛋白氮物质，在人类乳汁和其他哺乳动物的乳汁中普遍存在。在生命早期(出生后至2岁)，NTs在免疫系统的发育、肠道功能的成熟和神经系统的发育中起着至关重要的作用，因此被认为是一种“特殊的膳食营养素”。生命最初的0~3年是肠道微生物群（gut microbiota，GM）定植的基本时期，也是大脑和肠道发育最快、最活跃的阶段。GM显著影响脑神经发育，主要通过GM-肠-脑轴调节神经发育、内分泌系统和免疫功能，从而影响脑功能和行为。GM的α-多样性，特别是在特征微生物群拟杆菌和瘤胃球菌方面，与新生儿认知能力、表达性语言量表及其他评价显著相关。饮食中的NTs会影响GM成分。牛奶和食品中的多种活性因子已被证明可作为微生物营养物质，调节早期GM的形成，从而确保婴儿的健康发育。因此，有必要研究不同膳食NTs的影响及机制对早期婴儿GM-肠-脑轴形成的影响，为NTs补充配方奶粉的开发提供新的见解和理论基础。

方法

实验组：新生大鼠饲粮中添加NTs，对照组，安慰剂对照组；
新生大鼠的行为测试：
早期反射检测、平面调正反射检测、步态反射检测、前肢握力检测；
敞箱试验：在空地中心区域停留的时间；
新目标识别：分析新生大鼠的行为，包括鼻子或嘴巴接触物体的次数以及在距离物体2~3cm范围内的探索时间；
T型迷宫：分析新生大鼠左、右臂活动时间；
动物组织的取样和保存：出生后（PND）第3、13、21天的脑区和肠道组织，其中脑组织制作病理切片；
荧光定量RT-PCR和Western Blotting检测脑组织中目标基因和蛋白的表达；
脑组织神经元尼氏染色；
16s rRNA测序：盲肠组织细菌菌群DNA测序，DADA2算法对测序数据进行预处理，并通过SLIVA数据库进行物种注释；α-和β-多样性评估GM物种的丰富性、均匀性和差异；LEfSe分析鉴定组间特征菌群；利用PICRUSt 2预测微生物群的基因功能；
LC-MS非靶向代谢组学检测粪便样本代谢物。

技术路线

研究结果

膳食中不同水平的NTs补充影响新生大鼠早期行为发育

在不同浓度的NTs干预下，新生大鼠的体重较对照组和安慰剂组显著增加。20和40 mg/d干预组的体重增长率分别为7.9%和14.8%（Figure 1A）。NTs的补充对大鼠脑的重量没有显著影响，但增加了肝脏和肾脏的重量，尤其是在PND 21时的新生大鼠肾脏的重量（Figure 1B）。对PND 9和PND 12新生大鼠进行步态反射、翻正反射、负地面反射和握力测试。补充NTs对新生大鼠发育早期各反射活动的成熟均有一定影响，完成反射所需时间缩短（Figure 1C,D）。与对照组相比，不同剂量NTs的新生大鼠表现出更成熟的负向性地面反射（Figure 1D）。翻正反射和抓握力测试结果显示，添加40 mg/d NT后，新生大鼠翻正反射最成熟，抓握时间更长（Figure 1D）。与对照组相比，在空地中央补充NTs的新生大鼠活动时间增加，其中以20 mg/d组增加最为显著（Figure 1E）。T型迷宫右臂活动时间（含诱导源）和新生大鼠对新物体的识别指数有所提高。NTs添加量为20mg /d的组效果最为显著（Figure 1E）。此外，添加10和20 mg/d NTs的新生大鼠的新物体识别指数高于对照组（Figure 1E）。

饮食中摄取NTs可促进新生大鼠海马和额叶神经元的形成和成熟

为了阐明补充不同剂量的膳食NTs对脑神经发育的影响，对不同时期（PND 13和21）新生大鼠不同脑区（皮质、海马体和纹状体）神经发育各方面（如神经元发育、髓鞘发育和突触发生）的遗传生物标志物进行检测。与对照组和安慰剂组相比，饲粮中添加20和40 mg/d NTs的大鼠在PND 13和PND时前额叶皮层Sox2 mRNA水平显著上调（Figure 2A）。在海马体中，Sox2 mRNA仅在PND 21上表达显著上调，纹状体中未见明显变化（Figure 2B,C）。PND 13组新生大鼠前额叶Dcx mRNA水平也显著上调，而在PND 21组，仅补充20 mg/d nt可显著促进前额叶皮层和海马中Dcx的表达（Figure 2A,B）。同样，饲粮中添加NT对纹状体中Dcx mRNA水平无显著影响（Figure 2C）。与Sox2和Dcx的表达相似，饲粮中添加NTs后，PND 13时前额皮质Nse的表达显著升高；尽管PND 21有表达增加的趋势，但无统计学意义（Figure 2A）。在海马体中，添加10 mg/d的NTs显著促进了Nse mRNA的表达，而在纹状体中没有观察到变化（Figure 2B,C）。添加不同剂量NTs后，大鼠前额叶皮层、海马和纹状体中Tuj1 mRNA的表达趋势与Nse mRNA的表达趋势一致。在PND 13时，20 mg/d和40 mg/d NT添加组大鼠前额叶皮层Tuj1 mRNA水平升高，但变化不显著（P分别为0.051和0.1694）；PND 21时，海马组织中Tuj1的表达显著升高（Figure 2A-C）。

PND 13和PND 21的前额皮质Sox2、Dcx和Tuj1蛋白水平也被检测。Figure 2D-F显示了在PND 13和21时Western blot结果。在新生大鼠前额叶皮层中，添加不同剂量的NTs后，Sox2、Dcx、Tuj1水平均呈上升趋势，其中以20 mg/d组效果最为显著（Figure 2E）。这种模式与靶基因早期表达的数据一致（Figure 2A）。PND 21蛋白定量结果与同一时间点mRNA表达分析结果相似。在PND 21时，与Tuj1蛋白水平相比，饲粮添加NTs对前额皮质Sox2和Dcx蛋白水平的促进作用更为显著（Figure 2A,G）。

膳食中补充NTs可增加前额皮质的神经元数目

为了观察饮食NTs对各实验组大鼠大脑额叶皮层的影响，采用甲苯胺蓝进行尼氏染色。Figure 3A显示了各治疗组前额叶皮层的尼氏染色。Nissl体呈蓝紫色。定量结果显示，与对照组相比，添加20 mg/d NTs的新生大鼠在PND 13和21时Nissl体阳性神经元数量显著增加（Figure 3B）。长期补充不同剂量的NTs增加了发育后期的神经元数量（Figure 3B）。为了进一步验证尼氏染色的结果，我们测定了NeuN在前额皮质的表达水平。结果表明添加20 mg/d nt后，NeuN mRNA显著上调（Figure 3C）。与对照组相比，NSE表达水平在早期发育（PND 13）中显著上调，但在晚期发育（PND 21）中几乎保持不变（Figure 3C）。Figure 3D展示了NeuN和NSE的表达水平。蛋白质表达水平与mRNA的变化一致，均表明添加20 mg/d NTs可显著促进NeuN和NSE的表达（Figure 3E）。这一发现与切片中神经元数量的统计结果一致。

饲粮中添加NTs（20 mg/d）对新生大鼠GM的组成及功能的潜在影响

饮食因素在很大程度上影响早期婴儿GM的形成和组成。Figure 4A展示了牛奶和辅食中的饮食因素如何通过微生物群和相应的代谢物调节早期发育。根据测序样品的物种积累曲线分析，观察到的样品数量稳定，表明样品的测序深度和结果包含了绝大多数微生物物种。Chao1和Simpson指数反映出与新生大鼠相比，PND 13和PND 21新生大鼠肠道微生物的α-多样性显著升高。与对照组相比，饲粮中添加20 mg/d NTs的新生大鼠Chao1指数差异更显著（P = 0.0569, P = 0.0872），Simpson指数无显著变化（Figure 4A）。这一发现表明，随着发育过程，新生大鼠的转基因多样性逐渐增加。值得注意的是，虽然添加NTs的GM有更多类型的微生物，但菌群的均匀性没有受到影响。β-多样性结果表明，新生大鼠NTs补充组与对照组的肠道微生物组成涉及两个主要类别，差异有统计学意义（PND 13, P_adj = 0.029；PND 21, P_adj = 0.024，置换检验，Figure 4B）。在门水平上，拟杆菌门和厚壁菌门变化最大。与对照组比较，在PND 13时NTs补充组新生大鼠的拟杆菌增多，变形菌门减少，而在PND 21时，拟杆菌门和变形菌门的比例较对照组增加（Figure 4C）。通过LEfSE分析得到LDA分布直方图（Figure 4D）。在属分类水平上，g_Prevotellaceae NK3B31类群、g_Prevotellaceae UCG001类群、g_Christensenellae R_7类群、g_Akkermansia等微生物群落丰度在PND 13时显著增加（Figure 4E）。在PND 21时，g_Eubacterium xylanophilum group、g_Butyricicoccus、g_Ruminococcaceae ucg014、g_Akkermansia、g_Peptococcus等微生物群落的丰度显著增加（Figure 4F）。在这些群落中，g_Akkermansia在补充NTs后的整个发育阶段保持了高丰度。

Figure 5A,B显示饲粮添加NTs （20 mg/d）后，在属水平上显著提高了微生物的相对丰度。除g_Romboutsia、g_Enterococcus和g_Streptococcus在发育过程中呈逐渐下调趋势外，其余属在发育过程中均呈上调趋势（Figure 5C）。微生物功能预测结果表明，在PND 13时，与对照组和安慰剂组相比，给予补充NTs的新生大鼠GM在半乳糖代谢、核黄素代谢、链霉素生物合成、叶酸生物合成以及糖和淀粉代谢方面的功能显著增强（Figure 5D）。随着GM的发展，微生物的功能变得更加多样和复杂。在PND 21时，补充NTs新生大鼠的GM在丙酮酸代谢、核黄素代谢、三羧酸循环、精氨酸和脯氨酸代谢、叶酸生物合成等途径上的功能更显著增强（Figure 5D）。这些途径大多与NTs代谢直接或间接相关。

新生大鼠摄入膳食NTs（20 mg/d）可调节肠道代谢物水平

Figure 6A,B火山图为NT处理下筛选的差异代谢物（P < 0.05）。根据（S+V）图和火山图，在PND 13和PND 21分别鉴定出27和28个显著差异代谢物（VIP >1, fold change >1.5, P < 0.05）。Figure 6C显示不同发育阶段肠道差异代谢物的热图。富集分析结果显示在添加NTs的条件下，PND 13时肠道差异代谢物在嘌呤代谢、嘧啶代谢、精氨酸合成、精氨酸和脯氨酸代谢以及氨基酰基-tRNA生物合成等代谢途径中显著富集（Figure 6D）。在PND 21时，肠道差异代谢物在精氨酸和脯氨酸代谢途径中显著富集，伴随着诸如组氨酸代谢、色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢和β-丙氨酸代谢等信号通路（Figure 6D）。这些结果与微生物群的发育过程和功能变化相一致。此外，补充NTs的新生大鼠在PND 13时肠道嘌呤和嘧啶代谢途径受到的影响最为显著，腺苷、肌苷、次黄嘌呤、1-甲基黄嘌呤和肌酸的表达显著上调（Figure 6E）。这种上调可能与NTs进入肠道直接相关。

饲粮添加NTs新生大鼠中GM、肠道代谢物与经发育的关系

为了探讨NTs补充对早期GM-肠-脑轴发育影响的潜在机制，我们对不同发育阶段NTs补充下新生大鼠GM和肠道代谢物的差异上调以及神经元发育表型进行了Spearman相关分析（Figure 7A,B）。结果显示，在PND 13时神经元数量、Sox2和Dcx表达水平均与反式3-吲哚丙烯酸、丙酰肉碱、肌苷、次黄嘌呤、肌酸、l-谷氨酰- l-谷氨酸、腺苷和5-氨基戊酸正相关（Figure 7A）。此外，这些代谢物与PND 13新生大鼠肠道特征微生物属呈正相关。例如，反式-3-吲哚丙烯酸与g__Akkermansia、g__ASF356、g__Clostridium sensu stricto 2、g_Ruminococcaceae NK4A214组等肠道微生物属呈正相关（Figure 7A）。肌苷和腺苷与g_ christensenellaceae R - 7、g_ Enterococcus、g_ Negativibacillus、g_ Robinsoniella和g_ Romboutsia呈显著正相关（Figure 7A）。小分子化合物、微生物群和神经发育表型之间更详细的相关性见Figure 7A。随着新生大鼠的成熟，GM趋于稳定，代谢功能发生变化。Figure 7B为PND 21时补充NTs的新生大鼠神经发育水平与特有肠道微生物群和标记代谢物的相关性分析结果。PND 13的特征菌群和小分子代谢物与PND 21不同。Dcx和Sox2的表达水平及神经元数量与尿酸、棕榈油酸乙酯和16−羟基十六酸呈正相关（Figure 7B）。这些特征性代谢物也与g__Akkermansia、g__Negativibacillus和g__Peptococcus呈正相关，其中与g__Peptococcus相关性强（Figure 7B）。有趣的是，据报道，这些代谢物中的一些对神经发育和神经功能具有各种积极的调节作用。

【声明】内容源于网络

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