5+胃癌 CHST 家族基因的表达、免疫浸润、预后综合分析及部分实验验证- 大数跨境

中科生信

2024-04-01

导读：5+胃癌 CHST 家族基因的表达、免疫浸润、预后综合分析及部分实验验证

今天小编和大家分析一篇2024年3月发表在Translational Oncology（IF:5.0）杂志的文章《A comprehensive analysis of the expression, immune infiltration, prognosis and partial experimental validation of CHST family genes in gastric cancer》。以往的研究表明，碳水化合物磺基转移酶家族蛋白（CHSTs）在细胞外基质结构成分和癌症进展中起着至关重要的作用，然而，CHSTs对胃癌的影响还有待深入探究。为了探究这些问题，我们的研究试图利用TCGA、GEO和 GTEx数据库中的数据，全面了解CHSTs在胃癌中的表达、免疫浸润和预后影响。此外，我们还进行了实验验证，以阐明CHST14在胃癌中的特异性作用。我们的研究结果表明，大多数CHST在胃癌中高表达。基因拷贝数变异进一步表明，CHSTs在胃癌中普遍扩增，这表明其在疾病进展中的潜在相关性。有意思的是，作者注意到大多数CHSTs与免疫细胞浸润之间存在很强的正相关性。重要的是，CHSTs的大多数成员与胃癌的OS和PFI有关，尤其是CHST14和CHST9。多因素回归分析表明，CHST14是影响胃癌患者总生存期的独立预后因素。在进一步的实验验证中，我们的结果表明CHST14在胃癌中表达升高，敲除CHST14可抑制胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移和 EMT。此外，CHST14可能通过调控Wnt通路发挥其功能。总之，作者的研究通过分析多组学数据，全面分析了迄今为止尚未描述的 CHSTs在胃癌中的作用。重要的是，我们发现CHST14是胃癌恶性进展过程中的关键启动子，为胃癌治疗提供了潜在的靶点。

背景

胃癌对全球人类健康产生严重影响，发病率居世界第五位，死亡率居世界第四位。手术仍然是早期胃癌患者最有效的治疗方法。然而，由于早期胃癌生长缓慢且无症状，大多数患者被诊断为晚期疾病，导致错失最佳治疗机会。靶向治疗和免疫治疗的进步显著改善了这一患者群体的前景。尽管在诊断和治疗方面取得了进展，但在许多国家，胃癌的平均5年生存率仍低于40%。因此，寻找新的胃癌治疗靶点至关重要。

碳水化合物磺基转移酶蛋白家族（CHST）包括15个成员，主要位于细胞质和细胞膜中。CHST是细胞质基质的重要组成部分。它是促进组织重塑的关键酶，与癌症的发生有关。据报道，CHST11和CHST13在肝脏恶性肿瘤中高表达，通过激活MAPK通路促进肝脏恶性肿瘤的发生发展和化疗耐药。CHST12的下调抑制了胶质母细胞瘤的迁移能力。CHST15的高表达与胰腺癌患者的不良预后有关。然而，尚未报道该家族成员在胃癌方面的研究。

免疫疗法已成为胃癌的重要治疗方法。免疫检查点激动剂已被证明可有效延长胃癌患者的预后。此外，最近的研究强调，肿瘤免疫微环境的特征，包括免疫细胞浸润和免疫检查点，可以作为免疫治疗疗效的预测因子。鉴于免疫疗法在胃癌管理中的重要性，探索与免疫浸润和免疫检查点相关的新标志物将有助于检测胃癌免疫疗法反应。

Wnt/β-catenin信号通路在各种病理和生理过程中起着至关重要的作用。激活始于Wnt配体与细胞表面受体结合，启动细胞内事件，最终导致细胞质稳定和β-连环蛋白的积累。在没有Wnt信号转导的情况下，含有 Axin、APC和GSK-3β 的破坏复合物靶向降解β-catenin。Wnt配体结合可抑制该复合物，防止β-连环蛋白磷酸化和降解。因此，β-连环蛋白积累，转位到细胞核中，与TCF/LEF转录因子结合，驱动负责细胞增殖、迁移和侵袭的Wnt靶基因的激活。该通路的失调对癌症等疾病有影响，强调了其在发育生物学和治疗开发中的重要性。

本研究调查了CHST家族在胃癌中的作用，包括转录组学、基因组学、免疫浸润和预后。此外，还采用免疫组化（IHC）、免疫印迹、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和功能测定法验证CHST14在胃癌中的表达，阐明其生物学功能和潜在的调控机制。作者的研究结果将有助于进一步了解CHST家族，特别是阐明CHST4作为胃癌治疗靶点的潜力。

路线图如下（图1）

研究结果

CHSTs在胃癌中的mRNA表达

通过TCGA数据库分析发现，CHST1、CHST2、CHST4、CHST11、CHST12、CHST13和CHST14在胃癌中上调，而CHST9在胃癌中表达没有差异（图2为了进一步证实CHST家族在更大样本中的表达，进一步分析了来自TCGA和GTEx的210个正常组织和414个胃癌组织。结果表明，CHST1、CHST2、CHST4、CHST5、CHST6、CHST11、CHST12、CHST13、CHST14和CHST15在胃癌组中高表达，CHST3、CHST8、CHST9和CHST10在正常组织中高表达。(图2B），这与上述结果基本一致。

CHSTs相互作用和CNV突变分析

通过Spearman相关系数检验CHST成员之间的相关性，发现CHST1、CHST2、CHST3、CHST7、CHST8、CHST10、CHST11、CHST12、CHST13、CHST14和CHST15呈显著正相关。CHST5基因与其他基因呈弱负相关，CHST4、CHST6、CHST9与家族其他基因无显著相关性。其中，CHST11和CHST15之间的相关系数最高（0.64）（图3此外，我们利用STRING数据库预测蛋白质与CHST的相互作用，并建立了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。我们的分析不仅揭示了家族成员之间的相互作用，还揭示了与网络中其他蛋白质的相互作用，包括 B3GAT1、B3GAT2、ZNF469 等图3同时，使用cbioPortal数据库分析胃癌中CHST的遗传变化，我们发现不同胃癌亚型中存在两种或多种突变，并且扩增的改变在胃癌中最常见。

CHST与胃癌免疫浸润的相关性

肿瘤浸润免疫细胞已被确定为胃癌的重要预后指标。因此，通过ESTIMATE数据库（https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/）研究了CHST与免疫浸润之间的潜在相关性。在此分类中，StromalScore表示肿瘤微环境中基质细胞的比例，ImmuneScore表示免疫细胞的比例，EstimateScore对应于两个比例的总和。结果显示，CHST1、CHST2、CHST7、CHST8、CHST11、CHST12和CHST15与免疫细胞浸润呈正相关（图4同时，发现CHST1、CHST2和CHST11与ESTIMATEScore的相关性最强。与ImmuneScore最相关的三个是CHST2、CHST7和CHST11。与 StromalScore 最强的三个相关性是 CHST1、CHST7 和 CHST11 （图4然后通过TIMER数据库分析上述正相关CHST与不同免疫细胞类型的关系，发现它们与CD8T细胞、CD4T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润程度相关（图S2）。此外，还进一步探讨了这些检查点与CHST之间的关系。发现，与肿瘤浸润免疫细胞呈正相关的 CHST 也与 CD27、CD28、CD80、OX40 和其他免疫检查点（++表1).综上所述，研究结果表明，CHST的表达升高与免疫浸润增加有关，这表明免疫治疗有可能获得有利的结果。

生存模型构建与分析

为了进一步研究CHST表达对OS的影响，我们构建了LASSO预后回归模型，并筛选到5个关键基因，CHST1、CHST7、CHST9、CHST11和CHST14（图5A、B）。综合考虑这5个关键基因的表达谱，我们将胃癌患者分为高危组和低危组（图5随后的生存分析显示，高危组患者的总生存率较差（图5因此，构建了胃癌患者的预后风险计算公式。RiskScore = CHST1 × 表达水平 0.04368965 + CHST7 × 表达水平 0.04976309 + CHST9 × 0.09584138 表达水平 + CHST11 表达水平 × 0.01058861 + CHST14 表达水平× 0.04967637。验证该模型是否能准确预测胃癌患者的预后。我们根据中位风险评分将测试队列分为高风险组（n = 217）和低风险组（n = 216）。同时，构建PFI的LASSO预后回归模型，生成CHST4、CHST8、CHST9、CHST3和CHST145个关键因子（图5E，F）。和以前一样，我们计算了风险评分，并将患者分为不同的组（图5同样，高危组的预后明显更差（图5值得注意的是，CHST9 和 CHST14 同时影响 OS 模型和 PFI 模型。然后对2名成员进行进一步多因素回归分析，结果显示CHST14是胃癌的独立预后因素（表2).因此，后续研究将集中在CHST14上。

列线图构建

为了更准确地预测胃癌患者的预后，开发了一个列线图预后模型，该模型整合了年龄、性别、肿瘤分期（T、N、M）和CHST14（图6随后，利用ROC曲线验证了模型的检验能力。1年期、3年期和5年期的值分别为0.699、0.669和0.686，表明该模型具有良好的预测能力（图6此外，我们观察到基于预测和观察到的 1 年、3 年和 5 年生存率的列线图的校准曲线之间有很好的重叠，这表明我们的模型有可能为预测胃癌患者的生存持续时间提供有价值的指导。(图6C、D、E）。

CHST14在胃癌中的功能富集分析

为了更好地了解CHST14在胃癌发展中的作用，基于CHST14的表达水平对TCGA数据中的RNA seq数据进行了差异表达分析。共发现1394个差异表达基因。其中，738个基因上调，656个基因下调（图7A）.采用差异表达基因进行GO分析，从生物过程、细胞组成和分子功能三个层面揭示CHST14在胃癌中的功能作用。在分子功能方面，研究结果表明，CHST14主要参与胃癌的细胞外基质结构成分、肝素结合、激素活性、Wnt蛋白结合和细胞外基质结合（图7同时，进行KEGG进行通路富集分析。该分析的结果揭示了两种特定通路的显著富集，即ECM受体相互作用通路和Wnt/β-catenin信号通路（图7C），这与EMT的发展密切相关。因此，我们使用GEPIA数据库来研究CHST14表达与参与EMT 的关键分子Snail、MMP2和MMP9之间的关系。结果显示CHST14与这些关键的EMT相关分子之间存在正相关关系（图7C、D、E）。

CHST14表达的验证

来自TCGA、GTEx和GEO的证据（图8A）数据库表明，与邻近的非癌组织相比，CHST14在胃癌组织中的表达更高。为了进一步验证这些发现，我们进行了实验验证。首先，Western blotting检测CHST14在胃癌组织和细胞系中的表达;结果表明，与相应的邻近正常组织和胃粘膜细胞相比，CHST14在大多数胃癌组织和细胞系中的表达更高（图8B、C）。进一步对20对石蜡包埋的胃癌样本进行了HE染色和免疫组织化学分析，获得了相同的结果（图8D，E）。这些分析强调CHST14在胃癌中过表达。

CHST14在胃癌细胞中的功能分析

为了进一步研究CHST14在胃癌细胞中的作用，我们进行了一系列细胞功能实验。首先，我们用WB和RT-qPCR检测证实了CHST14 siRNA在SNU-719细胞中的敲除效果（图 9A，B）。接下来，我们利用CCK-8和EdU实验来评估其对细胞增殖的影响。结果表明，与对照组相比，下调CHST14导致SNU-719细胞增殖能力下降（图 9C、D）。此外，我们还采用了Transwell试验来评估细胞的迁移和侵袭能力。结果表明，下调CHST14会降低SNU-719细胞的迁移和侵袭能力（图 9E）。WB 实验显示，当CHST14被下调时，SNU-719 细胞中Snail、MMP2和MMP9蛋白水平降低，进一步证实了上述功能测试结果（图 9F）。此外，还观察到下调组中与Wnt/β-catenin信号通路相关的关键分子（β-Catenin、CyclinD1和c-Myc）的蛋白和mRNA水平下降（图 9G、H）。总之，这些结果高度证明了CHST14可能通过Wnt/β-catenin通路促进GC进展和EMT过程。

【声明】内容源于网络

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