今天小编和大家分析一篇2024年3月发表在J Inflamm Res（IF:4.5）杂志的文章《Identification and Analysis of PANoptosis-Related Genes in Sepsis-Induced Lung Injury by Bioinformatics and Experimental Verification》。脓毒症诱发的肺损伤（SLI）是脓毒症的一种严重并发症。PAN凋亡是炎症性程序性细胞死亡的一种新形式，在SLI中尚未得到充分研究。本研究旨在通过生物信息学和体内实验筛选和验证SLI中PAN凋亡的特征基因。
背景
脓毒症是一种常见的危及生命的全身性炎症疾病，主要是由于对病原体感染的反应失调引起的。在脓毒症的发展过程中，多个器官可能受损，肺部尤其脆弱，发生最早，也是最常见的衰竭器官之一。ARDS/ALI的主要病理特征是急性炎症、肺泡上皮损伤、肺间质水肿和免疫细胞浸润。目前几乎没有有效的药物或疗法来治疗脓毒症诱发的肺损伤（SLI），因此死亡率较高，预后较差。抗炎治疗、无创通气、有创机械通气、体外膜肺氧合和支持性护理是临床上的主要治疗方法。然而，脓毒症诱发肺损伤的确切分子机制仍不清楚，迫切需要开发新的有效治疗策略。
细胞死亡已被证明在感染、炎症性疾病、神经退行性疾病和癌症等疾病中发挥着至关重要的作用。随着细胞凋亡、热凋亡、自噬、铁凋亡和杯凋亡等细胞死亡模式的不断更新，最近的研究发现了细胞死亡模式之间复杂的交联过程。PANoptosis（“P”代表焦亡，“A”代表凋亡，“N”代表坏死性凋亡）是一种由 PANoptosome复合物调控的炎症性程序性细胞死亡，具有焦亡、凋亡和坏死性凋亡的关键特征。与PANoptosis相关的一些生物标志物包括TNF受体1（TNFR1），用于细胞凋亡的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase）-3、caspase-7和 caspase-8，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3），含有 CARD（ASC）的细胞凋亡相关斑点样蛋白、 Caspase-1和Gasdermin D（GSDMD）负责热凋亡，TNFR1、受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）、RIPK3、caspase-8和混合系激酶结构域样蛋白（MLKL）负责坏死，这些都与炎症性疾病的发病机制有相当密切的联系。在细菌感染过程中，机体主要通过TLRs和相关死亡受体（包括TRIF、FADD、MyD88和RIPK1），通过改变细胞死亡启动蛋白的激活状态、基因表达和蛋白定位来调节细胞死亡的激活和抑制，从而参与细胞凋亡。先前的研究发现，MiR-29a-3p可通过降低炎症因子水平和下调小鼠肺组织中与细胞凋亡相关的基因Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）、GSDMD、caspase-3、caspase-8和MLKL来改善ALI。此外，在脓毒症相关ALI的发病过程中，嗜热巨噬细胞可释放危险相关分子模式分子和危险信号，增强炎症反应。因此，不同类型的程序性细胞死亡参与了炎症反应和组织损伤，并在维持SLI组织稳态中发挥重要作用。由此可以推断，细胞凋亡可能与SLI的病理机制密切相关。
然而，PANoptosis在SLI中的作用仍不清楚，需要进一步探索。本研究使用 R工具和limma软件包对四组数据进行差异基因分析，然后将差异表达基因（DEGs）与PANoptosis基因合并，得到与PANoptosis相关的DEGs（SPAN_DEGs），进行功能富集分析。通过支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）、最小绝对收缩和选择算子（LASSO）逻辑回归以及随机森林（RF）等三种机器学习算法识别特征基因。随后，建立了诊断价值预测的诺模图和接收者操作特征曲线（ROC）。免疫浸润分析和特征基因与浸润免疫细胞的相关性研究了SLI的免疫机制。然后，进行基因相关性分析和差异表达分析，探讨特征基因的相关性和表达水平。最后，通过苏木精和伊红（H&E）染色以及动物实验中的定量实时PCR（qRT-PCR）对结果进行了验证。总之，这项研究可为SLI患者提供新的治疗靶点。
研究结果
SPAN_DEGs的鉴定及富集分析
合并后的GEO数据集包含25个对照组样本和26个SLI组样本（GSE15379, GSE23767, GSE52474和GSE60088，使用sva包去除批次效应后合并使用），这些样本经过归一化处理后以方框图显示（图1A）。在p值小于0.05和|log2FC| ≧ 0.5的条件下，共鉴定出675个DEGs，其中上调基因465个，下调基因210个。典型DEGs的火山图、热图和盒图直观地显示了差异表达分析的结果（图 1B-D）。PANoptosis基因集由27个焦亡相关基因、259个凋亡相关基因和15个坏死性凋亡相关基因组成（图1D）。将675个DEGs与PANoptosis基因组取交集，得到了24个常见基因，并将其定义为SLI的PANoptosis相关DEGs（SPAN_DEGs）（图 2A）。
之后构建了PPI网络来探索SPAN_DEGs之间的相互关系，PPI网络中共有24个节点和118条边（图2B）。为了进一步探究这些基因的重要性，节点的大小和颜色取决于其程度，节点之间联系的紧密程度用综合得分来表示（图 2C）。前15个GO术语显示在气泡图中（图 2D）。BP富集结果显示，SPAN_DEGs主要富集在细胞凋亡过程、核因子卡巴B（NF-κB）转录因子活性的正向调控、DNA结合转录因子活性的正向调控、细胞因子产生的正向调控、IL-8产生的正向调控等方面。CC富集结果显示其与膜筏、死亡诱导信号复合物、内质体膜、细胞质囊泡膜、洞穴有关。MF富集显示，SPAN_DEGs主要富集于肿瘤坏死因子受体超家族结合、死亡受体结合、内肽酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、Caspase招募结构域（CARD）结合。KEGG富集分析表明，SPAN_DEGs主要富集在TNF信号通路、NOD样受体信号通路、细胞膜DNA传感通路、Toll样受体信号通路、NF-kappa B信号通路中（图2E）。GSEA分析结果显示，SPAN_DEGs主要参与IL-17信号通路、NOD样受体信号通路（图2F）。总之，这些结果表明，NOD样受体信号通路和TNF信号通路是主要通路，表明它们可能参与了炎症反应和氧化应激。
特征基因的选择
通过SVM-RFE机器学习算法共获得了5个预测特征基因（CD14、GSDMD、DYNLL1、PSMD9和STAT3）（图 3A）。通过LASSO回归分析，从具有统计学意义的变量中筛选出7个预测特征基因（CD14、IL1β、TNF、IRF1、GSDMD、SNAI2和FAS）（图 3B）。通过RF算法筛选出相对重要的前10个基因（CD14、CASP4、IL1β、FAS、MYD88、GSDMD、BID、STAT3 和 IRF1）（图 3C 和 D）），。最后，用维恩图（Venn diagram）表明，通过上述三种机器学习算法的交集，找到了相互重叠的四个特征基因（CD14、GSDMD、IL1β和FAS）（图 3E）。
列线图构建
利用rms软件包构建了特征基因（CD14、GSDMD、IL1β 和 FAS）的诊断列线图（图 4A），并利用校准曲线评估了其预测效果。校准曲线的结果显示，模型的预测概率与实际概率相当一致，表明模型相当准确（图 4B）。此外，ROC 曲线分析也可用于评估预测的正确性。nomoscore、CD14、FAS、GSDMD 和 IL1β 的ROC曲线的AUC分别为 0.957、0.932、0.823、0.791和0.900，表明这些特征基因在模型中具有很高的诊断效率（图 4C和D）。
免疫微环境分析
对照组和SLI组免疫细胞和免疫功能的ssGSEA评分结果显示，剔除无统计学意义（p>0.2）的样本后，SLI组的CD8+ T细胞和B细胞低于对照组，其余免疫细胞和免疫功能均高于对照组（p<0.2）（图5A）。特征基因与免疫相关性的热图显示，GSDMD与肥大细胞、巨噬细胞、CD8+ T细胞呈负相关，而与其他细胞呈正相关。剔除无统计学意义的条目后，CD14、FAS和IL1β与其余所有免疫细胞和免疫功能呈正相关（图 5B）。
特征基因的表达水平及相关性分析
为了进一步确定对照组和SLI组之间四个特征基因的表达水平，进行了差异分析，结果发现这些特征基因在SLI组中高表达（p < 0.05）（图 6A-D）。热图和相关系数散点图的结果表明，FAS和CD14（r = 0.75，p < 1e-0. 5）、CD14和IL1β（r = 0.74，p < 1.4e-0.5）、FAS和IL1β（r = 0.7，p < 6.1e-0.5）呈正相关，表明特征基因CD14、FAS和IL1β在SLI中可能具有显著相似的特征（图7A-G）。
HE染色
Sham小鼠肺切片显示肺泡结构正常，肺泡腔容积相对均匀，肺泡间隔薄，无水肿或炎症浸润，细胞质染色均匀，细胞核清晰。而CLP组（盲肠结扎和穿刺（CLP）法建立SLI模型）小鼠肺泡充血、炎性渗出、肺泡隔增厚，肺损伤评分高于假手术组（P＜0.0001）（图8A和BB）。
qRT-PCR
qRT-PCR结果显示，CLP组肺组织中CD14、FAS和IL1β的mRNA表达水平显著高于假手术组（p < 0.05），与生物信息学分析结果一致（图9A-C）。然而，假手术组GSDMD的mRNA表达水平高于CLP组（p > 0.05）（图 9D）。
