今天小编和大家分享一篇24年3月23日发表在《Journal of Cellular and Molecular Medicine》（IF: 4.3）期刊的文章《Identification of key regulatory molecules in the early development stage of Alzheimer's disease》。
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种常见的不可逆神经退行性疾病，随着年龄增长其发病率显著增加。近年来，长链非编码RNA（lncRNA）作为竞争性内源RNA（ceRNA）在AD中的重要作用逐渐受到关注。本研究构建了与AD早期相关的lncRNA-ceRNA调控网络，以确定潜在的生物标志物。通过分析AlzData和GEO数据库中的数据，识别了差异表达基因（DEGs），并进行了功能富集分析和蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建。通过聚合功能基因组学（CFG）方法，分析了在AD病理变化发生前的大脑中差异表达的关键基因（earlyDEGs）。AlzData数据库还分析了不同神经细胞中earlyDEGs的表达水平。研究发现，四个lncRNA（XIST、NEAT1、KCNQ1OT1和HCG18）及四个miRNA（hsa-let-7c-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-129-2-3p和hsa-miR-214-3p）可能作为AD早期的生物标志物，调控Atp6v0b、Atp6v1e1、Atp6v1f和Syt1的表达。该研究为AD的早期诊断和治疗提供了新的见解和潜在靶点。
1. 数据准备及预处理：Alzdata和GEO数据库下载四个脑区的13个数据集（GSE12685、GSE36980、GSE48350、GSE5281、GSE53890、GSE66333、GSE15222、GSE28146、GSE29378、GSE29652、GSE37263、GSE26927和GSE26972）；
2. R包“Limma”进行差异表达分析；
3. R包“clusterProfiler”进行GO/KEGG富集分析；
4. STRING用于PPI网络构建；
5. PPI鉴定关键基因；
6. 聚合功能基因组学（CFG）分析；
研究设计如流程图所示（Fig 1）。从Alzdata数据库（http://www. alzdata.org/）下载了与AD相关的不同脑区的跨平台标准化表达数据，包括内嗅皮层(Entorhinal Cortex, EC)、海马(Hippocampus, HP)、颞叶皮层(Temporal Cortex, TC)和额叶皮层(Frontal Cortex, FC)。选择了13个GEO数据集（GSE12685、GSE36980、GSE48350、GSE5281、GSE53890、GSE66333、GSE15222、GSE28146、GSE29378、GSE29652、GSE37263、GSE26927和GSE26972），共涉及541个脑样本（269名AD患者和272名健康个体），进行进一步分析（Table 1）。
从Table 1的EC、HP、TC和FC对应的数据集中分别鉴定出：EC和对照组之间的716个DEGs（243个上调基因和473个下调基因），HP和对照组之间的311个基因（137个上调基因和174个下调基因），TC和对照组之间的1600个基因（568个上调基因和1032个下调基因），FC和对照组之间的242个基因（148个上调基因和94个下调基因）（log2FC > 0.5, P < 0.01）（Table 2, Fig 2A-H）；使用OmicStudio工具获取13个数据集的相交DEGs，最终鉴定出每个脑区27个DEG（Fig 2I）。
使用Metascape分析四个不同脑区DEG的GO富集功能和KEGG通路富集情况（p< 0.05）。GO富集分析表明EC和FC脑区的DEGs主要与神经元体成分有关（Fig 2J、M），而HP脑区的DEG主要与运输囊泡和化学突触传递有关（Fig 2K）。TC脑区的DEG主要与主要轴突成分有关（Fig 2L）。KEGG富集分析揭示EC、HP和TC脑区的DEG显著富集在突触囊泡循环通路（Fig 2N-P），而FC脑区的基因主要参与矿物质吸收（Fig 2Q）。
利用STRING数据库，Cytoscape软件对不同脑区DEGs的PPI网络进行了可视化。使用Cytoscape中的MCODE来识别该PPI网络中的显著子模块。在不同脑区的每个PPI网络中选择了子模块1作为关键基因，并在EC脑区鉴定出了41个关键基因、HP脑区29个关键基因、TC脑区12个关键基因、FC脑区11个关键基因（Table 3, Fig 3A-D）。
使用Metascape对4个脑区的关键基因进行重要通路和生物学过程的功能富集分析（p< 0.05）。生物学过程（BP）富集结果显示，EC脑区的关键基因主要参与调控胞吐，HP脑区的关键基因主要与化学突触传递有关；TC脑区和FC脑区的关键基因参与细胞趋化和翻译后蛋白质修饰（Fig 3E）。此外，KEGG通路富集EC脑区的关键基因显著富集在突触小泡循环相关的通路。HPEC脑区的关键基因主要与GABA能突触通路相关。相反，TC和FC脑区分别与趋化因子信号传导和PI3K-Akt信号通路有关（Fig 3F）。
在不同脑区的每个PPI网络中选择了子模块1作为关键基因（Fig 4A）。为了进一步验证所选关键基因与AD的关系，利用Alzdata中的CFG等级分析了29个在AD小鼠模型中AD病理发生前差异表达的earlyDEGs，以有效地理解关键基因的表达水平是否受AD基因变异的调控，并用Cytoscape软件将这些early-DEGs可视化（Fig 4B）。在Aβ或tau系AD小鼠模型中，与APP、PSEN1、PSEN2、APOE或MAPT相互作用相关的关键基因显著参与了AD病理变化。CFG排序结果显示，EC脑区的2个基因（GABRG2、GNG3）、HP脑区的3个基因（GABRG2、GNG3、SH3GL2）、TC脑区的2个基因（AGT、CXCL16）和FC脑区的1个基因（C3）与AD相关，其中GABRG2、CXCL16和C3与Aβ和tau强相关。此外，关键基因的参与的BP主要富集在吞噬体酸化和质子跨膜转运中（Fig 4C）。通路富集结果显示，突触囊泡循环是与关键基因有关的主要通路（Fig 4D）。
根据通路富集的结果，在四个脑区（EC、HP、TC和FC）中分别选择了与突触小泡循环相关的七个基因（Atp6v0b、Atp6v0c、Atp6v0d1、Atp6v1e1、Atp6v1f、Slc17a7和Syt1）（Table 4）。使用Alzdata检查了Hub基因的表达水平，其中ATP6V1E、Slc17a7和Syt1的表达有显著差异（Fig 4H、J、K）。
利用miRWalk 2.0(http://zmf.umm. uni-heidelberg.de/mirwalk2)预测了靶向突触小泡循环相关Hub基因的miRNA。使用三个数据库（包括miRWalk、miRNet和miRTarBase）分别预测miRNA并取交集，得到的48个miRNA，用Cytoscape进行了进一步处理和可视化（Fig 5A）。共鉴定出12个靶向两个或两个以上基因的miRNA（Fig 5B），其中4个靶向Atp6v0b、Atp6v1e1、Atp6v1f、Slc17a7和Syt1的miRNA与上调的miRNA交叉后出现差异表达（Fig 5C-D）。然后，进一步在单细胞水平上分析了Atp6v0b、Atp6v1e1、Atp6v1f、Slc17a7和Syt1的表达情况。结果表明，除了Slc17a7外，其他四个基因（Atp6v0b、Atp6v1e1、Atp6v1f和Syt1）在脑细胞中也存在显著的表达差异（Fig 5E-I）。根据ceRNA假设，鉴定出了以lncRNA为靶标的hsa-let-7c-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-129-2-3p和hsa-miR-214-3p。用4个lncRNA（HCG18、KCNQ1OT1、NEAT1和XIST）、4个miRNA（hsa-let-7c-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-129-2-3p和hsa-miR-214-3p）和4个mRNA（Atp6v0b、Atp6v1e1、Atp6v1f和Syt1）构建了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络（Fig 5J）。
