今天小编和大家分析一篇2024年2月发表在J Immunol Res（IF:4.818）杂志的文章《KIF26B and CREB3L1 Derived from Immunoscore Could Inhibit the Progression of Ovarian Cancer》作者使用卵巢癌（Ovarian cancer，OV）转录组数据，鉴定了两个与OV免疫评分相关的枢纽基因模块，发现了6个与OV免疫相关的枢纽基因，其中KIF26B和CREB3L1有望成为OV免疫治疗的潜在靶点。
背景：
OV是女性最致命的妇科恶性肿瘤，OV在所有妇科肿瘤中致死率最高（67.33%）。目前OV的标准治疗方法是手术联合铂类和紫杉醇化疗。虽然靶向治疗等新治疗方法已应用于OV治疗，但OV的5年生存率并未明显提高。现有研究认为，免疫在肿瘤的发生和发展中至关重要且复杂。同时，免疫也揭示了肿瘤治疗的新方向。然而，OV的免疫治疗研究尚未取得显著进展。在已发表的研究中，证明免疫评分可以用作OV的潜在预后生物标志物。本研究对免疫评分进行了进一步分析，旨在探究免疫的作用，揭示潜在的致病机制，并发现OV的潜在免疫治疗靶点。
方法：
1.从UCSC Xena（http://xena.ucsc.edu）下载OV的RNA测序数据和临床病理学特征。TCGA OV的免疫评分（n=172）是从之前的研究中获得的。GSE18520和GSE26712从Gene Expression Omnibus（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下载。
2.加权基因共表达网络分析（WGCNA）。删除了172个TCGA样本中具有异常值的OV样本。然后，对样本和相应的临床表型进行聚类。根据β对基因进行加权相关性分析。然后，对加权基因矩阵进行聚类，并合并相似度高的模块，以识别基因模块。计算基因模块与不同OV临床表型的相关性。Hub基因模块具有与免疫评分最显著的相关性（包括正相关和负相关）的特征。最后计算了基因显著性（GS）和模块成员（MM），其中枢纽基因模块中关键基因的选择标准为GS > 0.2，MM> 0.8。
3.采用ClusterProfiler软件包对基因本体论（GO）术语和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路进行富集分析。
4.在Cytoscape软件中对这些基因进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，以建立PPI网络并探索它们之间的相互作用。
5.GSE18520和GSE26712的正常卵巢组和OV组的差异表达基因（DEGs）分别通过Limma Package进行分析。利用这两个数据集中上调的DEGs和下调的DEGs的交集来过滤与OV免疫相关的枢纽基因。
6.SKOV3细胞系购自Procell（中国武汉）。细胞培养后在收获细胞进行进一步实验。使用 Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA）从 SKOV3 细胞中提取总 RNA。在Roche LightCycler® 480 II实时荧光定量PCR系统上进行qRT-PCR。
7.细胞活力测定：MTT检测、CCK8检测、伤口愈合试验、细胞侵袭试验、蛋白质印迹分析
8.统计分析：研究中的生物信息学分析是在 R Studio 3.6（使用 R 3.6.0 和 Java 10.0.2）中进行的。采用Pearson方法计算相关系数。在实验部分，使用FIJI（图像J2）进行图像分析，使用Graphpad Prism 9进行绘图统计。统计方法是单因素方差分析，然后是Dunnett检验进行多重比较。在整个分析中，P< 0.05 被认为具有统计学意义。
研究结果：
WGCNA鉴定OV中与免疫评分相关的两个枢纽基因模块
在之前的研究中，发现免疫评分在预测OV的预后方面起着关键作用。因此，通过对172个TCGA OV数据和5,000个基因进行WGCNA来检测与免疫评分密切相关的中心基因模块。首次对OV样本进行聚类时，发现并删除了异常样本。随后对171个OV样本进行了第二次聚类分析，并整合了相应的临床表型（OS、事件、分期、分级、年龄、淋巴结转移、残余肿瘤直径和免疫评分）。根据R2和平均连通性，选择β=6（R2= 0.9）作为软阈值，以建立更接近无标度网络的网络。对5000个基因进行加权相关性分析，动态杂交切割可以收集到具有相似表达模型的基因。结果，这些基因被分为九个具有不同基因编号的基因模块：黑色（n= 102）、蓝色（n= 1,071）、棕色（n= 947）、绿色（n= 433）、品红色（n= 37）、粉红色（n= 101）、红色（n= 175）、绿松石色（n= 1,522）和黄色（n= 612）。
细胞外基质和病毒感染与枢纽基因模块中的基因相关
对枢纽基因模块中的基因进行GO项和KEGG通路富集分析。首先进行了GO术语扩充分析。结果表明，蓝色模块中的基因主要富集在细胞外基质组织、细胞外结构组织、细胞外基质、含胶原的细胞外基质、细胞外基质结构成分等细胞外基质相关项目。红色模块富集的GO项与炎症反应显著相关，如对病毒的反应、对其他生物体的防御反应、对病毒的防御反应、I型干扰素信号通路、细胞对I型干扰素的反应、对I型干扰素的反应。
随后，对这两个模块进行了KEGG通路富集分析。在蓝色模块中，主要富集的KEGG通路是PI3K-Akt信号通路和人瘤病毒（HPV）感染。一些与病毒相关的KEGG通路也富集在红色模块中，如EB病毒感染和单纯疱疹病毒1（HSV1）感染。
根据WGCNA中计算的基因的度数和权重，在Cytoscape软件中构建并可视化了蓝色模块和红色模块的PPI网络。分别从两个完整的PPI网络中提取两个子网。蓝色模块的子网包含75个节点和2,664条边，子网中的许多基因（如CREB3L1、COL5A1、MMP14、PRRX1和ADAM12）相互关联或与肿瘤相关。红色模块的子网包含24个节点和259条边，2′-5′-寡腺苷酸合成酶（OAS）家族中的许多成员（如OAS1、OAS2、OAS3和OASL）出现在子网中。
鉴定与OV免疫相关的枢纽基因
通过蓝色和红色模块中基因的GS和MM过滤枢纽基因模块中的关键基因。结果获得了蓝色模块的92个关键基因和红色模块的25个关键基因。在GSE18520，得到了13,266个DEGs（OV中8,332个上调DEGs和4,934个下调DEGs）。在GSE26712，得到了7,409个DEGs（OV中4,605个上调DEGs和2,804个下调DEGs）。由于蓝色模块与免疫得分显著正相关，而红色模块与免疫得分显著负相关，将蓝色模块中的关键基因与GSE18520和GSE26712中上调的DEGs相交，将红色模块中的关键基因与GSE18520和GSE26712中下调的DEGs相交。最后，在蓝色模块中得到了四个上调的中枢基因（LOXL2、LZTS1、KIF26B和CREB3L1），在红色模块中得到了两个下调的中枢基因（TRIM22和DDX60）。这些基因不仅是OV组织和正常卵巢组织中的DEGs，也是与OV免疫得分相关的中枢基因模块中的关键基因，因此我们将它们视为与OV免疫相关的中枢基因。
敲低KIF26B和CREB3L1基因表达抑制SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭
分析了敲除KIF26B和CREB3L1表达后SKOV3细胞的生物学行为。首先通过qRT-PCR筛选了合适的针对KIF26B和CREB3L1的siRNA（小干扰RNA）序列。结果表明，siK556和siC593可分别显著敲低KIF26B和CREB3L1的基因表达，并被用于随后的SKOV3细胞实验。细胞活力检测（MTT和CCK8）显示，敲除KIF26B和CREB3L1会降低SKOV3细胞的活力。因此，认为敲除KIF26B和CREB3L1可以抑制SKOV3细胞的增殖。
然后继续通过伤口愈合实验和细胞侵袭实验来检测KIF26B和CREB3L1是否会影响SKOV3细胞的迁移和侵袭。伤口愈合实验结果显示，敲除KIF26B和CREB3L1后，SKOV3细胞在培养24小时和48小时后伤口愈合率增加，这说明敲除KIF26B和CREB3L1可以抑制SKOV3细胞的迁移。细胞侵袭实验结果表明，敲除KIF26B和CREB3L1能显著减少SKOV3细胞的侵袭细胞数。因此，认为敲除KIF26B和CREB3L1可以抑制SKOV3细胞的侵袭。
KIF26B和CREB3L1通过PCNA和Wnt/β-Catenin通路影响SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭
研究表明，KIF26B和CREB3L1与SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭有关。因此对相关机制进行了进一步研究。增殖细胞核抗原（PCNA）是一种分子量为36 KD的蛋白质。它参与细胞增殖的启动，是细胞增殖状态的指标。同时，有研究者报道Wnt/β-catenin信号通路参与了多种肿瘤的增殖、迁移和侵袭。因此，通过WB（western blot）检测了敲除KIF26B和CREB3L1基因表达的SKOV3细胞中PCNA、Wnt5 a/b和β-catenin蛋白的表达。结果显示，敲除KIF26B和CREB3L1可降低PCNA、Wnt5 a/b和β-catenin的表达。总之，推测敲除KIF26B和CREB3L1可通过调节PCNA和Wnt/β-catenin通路抑制OV的增殖、迁移和侵袭。
