今天小编和大家分析一篇24年8月发表在Respiratory Research（IF:4.7）杂志的文章《Identification of TFRC as a biomarker for pulmonary arterial hypertension based on bioinformatics and experimental verification》。作者基于两个独立公共数据集的验证和实验验证，TFRC被确定为肺动脉高压（PAH）中潜在的分子生物标志物，以TFRC为靶点可能是诊断和治疗PAH的一种有前途的策略。
背景：
肺动脉高压（PAH）是一种复杂的进行性疾病，其特征为肺动脉压力升高，最终导致右心衰竭。尽管已研发出多种针对PAH的靶向疗法，可有效缓解症状，但这种严重疾病的预后仍然较差。新诊断患者的五年生存率仅为61.2%。因此，PAH的早期诊断对患者至关重要，目前迫切需要明确PAH的潜在发病机制并确定相关生物标志物。近年来，生物信息学的发展使PAH的分子基础有了更深入的认识。生物信息学分析方法有助于识别与PAH发展相关的候选基因，为诊断或预后生物标志物及治疗靶点提供有价值的指导。然而，目前许多研究仅进行理论预测，并未通过实验验证其可靠性。
方法
1.从GEO数据库中筛选PAH转录组数据集；
2.通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）确定与PAH相关的模块；
3.富集分析及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建；
4.验证Hub基因表达；
5.基因集富集分析（GSEA）；
6.PAH大鼠模型建立及临床样本收集；
7.定量PCR（qRT-PCR）分析及western blot分析。
研究结果
差异表达基因（DEGs）的鉴定
生成了二维主成分分析（PCA）聚类图，以展示合并GSE131793和GSE113439前后批次间的差异（图 1A和图 1B）。分析显示，两组样本呈现出明显的聚类。如火山图（图 1C）和热图（图 1D）所示，共鉴定出914个DEGs，其中上调基因722个，下调基因192个。
WGCNA
使用Pearson相关系数对样本进行聚类，并据此构建样本聚类树（图 2A）。最终选择10作为软阈值参数，以确保网络具有无标度特性（图 2B）。接下来，构建邻接矩阵和拓扑重叠矩阵（TOM）。最后，基于平均层次聚类和动态剪枝法识别出10个模块。通过模块-性状关系热图（图 2C）评估并可视化每个模块与两种临床特征之间的相关性，结果表明MEturquoise与PAH具有高度相关性（r = 0.68，P < 0.001）。因此，MEturquoise作为关键模块，包含3,208个基因。DEGs和WGCNA结果中得到807个交集基因（图 2D）。
功能富集分析
基因本体论（GO）富集分析表明，这些基因在多个生物学过程（BP）中富集，如核糖体生物发生、肌肉收缩、细胞对热的反应、对锰离子的反应以及对rRNA 加工的正向调控。在细胞组分（CC）方面，富集涉及核斑、细胞前缘、中心粒、中心粒卫星和前核糖体。此外，分子功能（MF）类别显示，在ATP水解活性、GTP酶结合、作用于DNA的催化活性、解旋酶活性以及依赖ATP且作用于DNA的活性等功能上显著富集（图 3A）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示，在与癌症中的蛋白聚糖、肌动蛋白细胞骨架调节、脂质与动脉粥样硬化、黏着斑以及NOD样受体信号通路显著富集（图 3B）。另外，在疾病组和对照组之间进行的比较富集分析表明，PAH可能与心血管系统紊乱以及全身性疾病相关，如心肌梗死、动脉粥样硬化性心血管疾病、肺动脉高压、动脉粥样硬化（图 3C）。
PPI网络构建和hub基因鉴定
基于807个交集基因构建了PPI网络。利用CytoNCA插件分析网络拓扑结构并识别其中的核心基因。采用四种算法计算交集基因的连通度。选取每种算法中排名前20的基因（图 4A-D）。对这4种算法的结果取交集，确定了8个hub基因，即HSP90AA1、CD8A、HIF1A、CXCL8、EPRS1、POLR2B、TFRC和PTGS2（图 4E）。
Hub基因表达验证
在验证集中进一步评估hub基因的表达水平。箱线图显示，hub基因在训练集（图 5A）以及验证集GSE53408和GSE22356（图 5B和图 5C）中的表达水平存在差异。在训练集和验证集GSE53408中，HSP90AA1、HIF1A、CXCL8、EPRS1、POLR2B、TFRC和PTGS2在PAH组中的表达显著高于对照组，而CD8A在PAH组中的表达显著低于对照组。在验证集GSE22356中，TFRC是唯一仍呈现差异高表达的基因，因此选择TFRC作为关键基因进行进一步分析。
GSEA
GSEA（图 6A-B）显示，在TFRC高表达PAH样本中，大多数基因在以下生物学过程中富集：细胞周期检查点信号传导、染色体分离、模板依赖性DNA复制、有丝分裂姐妹染色单体分离以及核染色体分离。由于细胞增殖和炎症浸润是PAH发病机制的特征，功能和通路富集分析均表明TFRC在PAH发病过程中具有潜在作用。在验证数据集中使用受试者工作特征曲线（ROC），进一步验证目标基因的诊断效能，在GSE53408和GSE22356中，TFRC呈上调状态，其曲线下面积（AUC）分别达到0.8788（图 6C）和0.7056（图 6D），表明TFRC的表达水平能够区分PAH患者和健康对照。
PAH大鼠动物模型验证TFRC
建立了PAH大鼠动物模型，PAH组的右心室收缩压（RVSP）（38.41 ± 4.75 mmHg）显著高于对照组（20.86 ± 4.61 mmHg）（p < 0.001）（图 7A）。此外，右心室肥厚（RVH）显著增加，表现为野百合碱（MCT）处理的大鼠的右心室与左心室加室间隔重量比（RV/LV + S）为 32.97% ± 6.48%，而对照组为22.36% ± 5.01%（p < 0.05）（图 7B）。另外，PAH大鼠的肺动脉中膜壁明显厚于对照大鼠（图 7C-D）。随后检测了PAH大鼠肺组织中靶基因的mRNA表达。结果显示，TFRC在PAH大鼠的肺组织中显著上调（图 7E）。蛋白水平验证结果表明，TFRC在PAH大鼠肺组织中的蛋白表达量约为对照大鼠肺组织中的1.5倍（图 7F）。
临床样本验证TFRC
基于上述生物信息学分析和实验验证，发现TFRC是唯一一个在PAH组中表达持续上调的靶基因。因此，选择TFRC进行进一步的实验验证。首先，收集了15名特发性肺动脉高压（IPAH）患者和15名健康对照者的血液样本，以测定血清TFRC浓度。IPAH患者的血清TFRC浓度显著高于健康对照者（图 8A）。使用ROC曲线分析评估TFRC水平对PAH的诊断能力，结果显示AUC值为0.7511，表明TFRC作为诊断生物标志物具有较高的预测效率（图 8B）。
