今天小编和大家分析一篇2023年9月发表在Int J Biol Sci（IF:4.0）杂志的文章《Glycine Decarboxylase (GLDC) Plays a Crucial Role in Regulating Energy Metabolism, Invasion, Metastasis and Immune Escape for Prostate Cancer》。甘氨酸脱羧酶（GLDC）是甘氨酸代谢的核心酶之一，其在前列腺癌（PCa）中的生物学作用尚不清楚。首先，研究发现GLDC在TCGA PCa 患者的糖酵解中起着核心作用。随后，代谢组学微阵列显示，GLDC增强了PCa细胞的有氧糖酵解，GLDC及其酶活性增强了PCa细胞中的葡萄糖摄取、乳酸产生和乳酸脱氢酶（LDH）活性。其次，发现GLDC在PCa中高表达，直接受缺氧诱导因子（HIF1-α）调控，并调控下游LDHA表达。此外，GLDC及其酶活性在体内和体外均表现出较强的促进PCa迁移和侵袭的能力。GLDC高组比GLDC低组具有更高的TP53突变频率、更低的CD8+ T细胞浸润、更高的免疫检查点表达和更高的免疫排除评分。最后，基于GLDC的预后风险模型应用LASSO Cox回归对PCa患者的临床特征和生存率也显示出良好的预测能力。这一证据表明，GLDC在PCa的糖酵解代谢、侵袭和转移以及免疫逃逸中起着至关重要的作用，是前列腺癌的潜在治疗靶点。
前列腺癌（PCa）是全球第二大常见癌症，也是全球男性癌症死亡的第五大原因。局部晚期前列腺癌患者接受根治性手术的五年生存率为92.3%，而远处转移性PCa患者综合治疗后的比例不足30%，表明转移是前列腺癌治疗失败和死亡的主要原因。此外，肿瘤糖酵解是一种能量代谢模式，可以迅速为细胞代谢、增殖、侵袭和转移提供能量。简而言之，快速获取ATP可以促进癌细胞的生长；提高PDKs、LDHs等酶的水平，帮助肿瘤逃逸；其代谢产物为癌细胞转移提供必要的微环境。由于肿瘤免疫逃逸是肿瘤进展的另一个主要原因，其机制可能由免疫细胞（CD8+ T细胞、NK细胞、Treg细胞等）的浸润水平和免疫检查点（PD-1、PD-L1、CTLA-4等）的表达水平来解释。这一证据表明糖酵解代谢、免疫逃逸、侵袭和转移在肿瘤（如前列腺癌）的进展中具有重要意义。
甘氨酸脱羧酶（GLDC）是参与调节甘氨酸代谢的核心代谢酶之一。GLDC功能异常是非酮症性高甘氨酸血症的主要原因。GLDC单核苷酸多态性与非酮症性高甘氨酸血症密切相关。这些研究表明，GLDC主要通过代谢酶介导相关疾病的发生和发展。先前的一项研究表明，GLDC在NSCLC干细胞中过表达，并通过增强糖酵解和嘧啶代谢来增强NSCLC干细胞的致瘤能力，这表明GLDC与肿瘤中的糖酵解之间存在潜在联系。然而，其在前列腺癌中的生物学作用和分子机制尚不清楚。同时，肿瘤糖酵解也提示，缺氧可能是诱导许多致癌基因上调或激活的主要因素之一。缺氧诱导因子（HIF-1α）作为恶性肿瘤的预后因子和转录因子，在许多恶性肿瘤以及前列腺癌中高表达。此外，乳酸脱氢酶A（LDHA）作为糖酵解的关键酶，在包括前列腺癌在内的许多实体瘤中具有促进Warburg效应和不良预后的生物学功能。然而，GLDC、HIF-1α和LDHA之间是否存在特定的调控机制尚不清楚。肿瘤糖酵解产生大量乳酸，抑制免疫细胞（如CD8+ T细胞和NK细胞）的浸润和活性，可能导致肿瘤免疫逃逸。最近，HX等人提出GLDC在调节三阴性乳腺癌（TNBC）细胞增殖和肿瘤免疫浸润方面具有潜在作用。这一证据表明，GLDC可能通过介导肿瘤糖酵解来影响免疫细胞浸润或肿瘤免疫逃逸，其在前列腺癌中的作用有待进一步证实。
本文旨在探讨GLDC在糖酵解代谢中的核心作用及其在促进前列腺癌侵袭、转移和免疫逃逸中的生物学功能。本研究将为前列腺癌的精准治疗提供新的靶点和理论依据。
1. 数据来源
2. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）
3. 功能富集分析
4. 聚类分析
5. 预后风险模型的建立
6. 细胞系和处理
7. 细胞转染
8. 蛋白质印迹
9. 伤口愈合试验
10. Transwell测定
11. 代谢测定
12. 体内动物研究和生物发光成像
13. 统计分析
首先，TCGA患者的929个代谢相关基因中有647个（68.6%）在正常（51例）和前列腺癌（489例）组织中差异表达，其中334个基因在肿瘤中上调，313个基因下调（图1A）。接下来，我们对647个差异表达基因进行了WGCNA分析，结果显示这些基因可以很好地聚集成6个基因模块，其中红色基因模块与更好的临床预后相关（临床T分期（r = -0.14）、Gleason评分（r = -0.33）、病理N分期（r =-0.18）、病理T分期（r = -0.3）、 初次治疗成功（r=0.17），二次治疗成功（r=0.24），均P <0.05（图1B，C）。因此，我们对红色基因模块中的16个基因进行了功能富集分析，结果表明，这些基因主要富集在糖酵解和丙酮酸代谢相关途径中（图1D）。这些结果表明，糖酵解是前列腺癌的关键能量代谢模式。
接下来，基于647个差异表达基因的表达水平进行了聚类分析，发现这些基因可以很好地将患者聚为3组（C1、C2和C3），这些组在预后上存在显著差异，其中C3的生化复发概率更高（图2A、B）。接下来，对3个聚类进行代谢基因鉴别分析，结果显示C1、C2有70个分化基因，C1、C3有39个分化基因，C2、C3有88个分化基因，C1、C2、C3中有6个代谢相关分化基因（GLDC、PLA2G7、CA3、CD38、PDE5A、CDO1）（图2C，D）。
此外，发现根据TCGA患者，GLDC与糖酵解相关基因之间存在中等相关性（图2E）。接下来，根据GLDC表达的中位值，将489例TCGA患者分为GLDC高组和GLDC-低组，发现GLDC-高组的那些糖酵解相关基因的平均表达水平高于GLDC-低组（图2F）。接下来，在LNcap和22RV1细胞中过表达或敲低GLDC后进行了代谢测序分析，总离子色谱（TIC）色谱图显示，所有样品都具有信号强、峰容量大、保留时间重现性好的特点（图2G）。PCA和PLS-DA分析显示，原发性前列腺癌细胞系（22RV1）和转移性前列腺癌细胞系（LNcap）之间存在显著的代谢差异（图2H）。在LNcap细胞（LNcap-siG组）GLDC基因表达下调后，PCA、PLS-DA和OPLS-DA显示，与空载体（LNcap-NC）组相比，代谢模式有显著改变（图2I）。2同样，与对照组相比，22RV1细胞中GLDC表达的上调显着改变了代谢模式。
将LNcap-NC组与LNcap-siG组进行比较，共鉴定出37种差异调控物质，其中13种物质减少，24种物质增加。值得注意的是，与LNcap-siG组相比，LNcap-NC组的丙酮酸、乳酸产生和葡萄糖消耗量有所增加。将22RV1-G（GLDC过表达组）与22RV1-NC组进行比较，筛选出8种差异代谢产物，其中3种物质减少，5种物质增加。值得注意的是，与22RV1-NC细胞相比，22RV1-G细胞的3-磷酸甘油酸产生和葡萄糖-6-磷酸消耗量增加。为了表征不同代谢物之间的相关性，使用Pearson相关性分析来量化这些代谢物的定量信息。热图分析显示，前列腺癌细胞系不同GLDC表达组的代谢物存在差异（图2J）。通路分析结果显示，与LNcap-siG组相比，LNcap-NC组的糖酵解和丙酮酸代谢相关通路显著富集，与22RV1-NC组相比，22RV1-G组的糖酵解相关通路也显著富集（图2K）。接下来，进一步发现，在正常和缺氧的DU145细胞中，随着GLDC表达的下调，葡萄糖摄取，乳酸产生和LDH活性显着降低（图2L）。在22RV1细胞的正常和缺氧环境中，随着GLDC表达的上调，葡萄糖摄取，乳酸产生和LDH活性显着增加。这一证据表明GLDC在促进前列腺癌糖酵解方面起着关键作用。
此外，p-GLDC组22RV1细胞的葡萄糖摄取、乳酸产生和LDH活性显著增加，而p-MT-GLDC组则无统计学意义（图2M）。也就是说，GLDC基因的点突变可以显著上调GLDC的表达，但不能促进22RV1细胞的糖酵解。这些结果表明，GLDC及其酶活性对于PCa中的糖酵解至关重要。
探讨GLDC对前列腺癌糖酵解的上游调控机制。首先，UCSC基因数据库预测HIF-1α与GLDC转录起始区之间存在两个直接结合位点（图3A）。接下来，设计了两种引物来预测结合位点（图3B）。此外，ChIP实验证实，HIF-1α通过直接与预测的结合位点1结合来调节 GLDC的表达（图3C，3C、D、E、F）。此外，发现GLDC在TCGA前列腺癌患者中的基因表达425中与HIF-1α具有很好的相关性（图3G）。将HIF-1α siRNA转染到LNcap细胞后，GLDC的蛋白表达下调（图3H）。这些结果表明，HIF1-α通过直接与GLDC结合来调节前列腺癌中的GLDC。
探讨GLDC在前列腺癌中的下游调控机制。首先，发现GLDC-high组的LDHA表达水平高于GLDC-low组，且在489例TCGA患者中，GLDC与乳酸脱氢酶A（LDHA）的基因表达相关性较好（图3I，J）。此外，将GLDC siRNA转染到LNcap细胞后，LDHA的基因和蛋白表达下调（图3K-M）。LDHA 已被确定有助于肿瘤中的糖酵解，这加强了 GLDC 促进前列腺癌糖酵解的证据。接下来，发现与对照组相比，p-GLDC组的乳酸浓度上调，p-GLDC组用LDHA抑制剂治疗后乳酸生成水平显着降低，这表明GLDC通过LDHA上调了乳酸水平（图3N）。此外，发现2.5μmol/L的LDHA抑制剂具有最佳的乳酸生成抑制浓度（图3O）。这些结果表明，GLDC通过调节LDHA促进糖酵解代谢。
首先，分析了TCGA数据库中51例正常和489例前列腺癌患者GLDC的表达，结果显示前列腺癌样本中GLDC mRNA水平明显高于正常前列腺组织中的GLDC mRNA水平（图4A）。此外，根据TCGA患者的分析，与前列腺癌原发组（N0）相比，淋巴结转移组（N1）的GLDC显著上调（图4B）。此外，GLDC在AR扩增和ERG融合的患者中也高表达（图4C，4C，F）。此外，证实GLDC在前列腺癌中高度表达，特别是在转移性前列腺癌中，无论是在组织（M1肿瘤）还是细胞系（DU145，LNcap）中（图4D，4D、E）。此外，当GLDC在LNcap细胞中过表达时，发现AR和AR-V7的蛋白表达水平升高，而当GLDC被敲低时，AR和AR-V7的基因和蛋白表达水平下调（图4G-I）。这一证据表明，GLDC在转移性前列腺癌中高度表达，并与AR和AR-V7具有调节关系。
接下来，进行了TCGA患者GLDC的生存分析，结果显示，GLDC-高组的PCa患者的无进展生存率明显低于GLDC-低组（图4J）。此外，当病理T分期（图4K）或格里森评分相同（图4L），GLDC高组的无进展生存率也显著低于GLDC-低组的PCa患者。这一证据表明，GLDC对前列腺癌患者的预后有显著影响。
为进一步评价GLDC在PCa预后中的关键作用，根据TCGA和GEO数据集中的基因表达水平，将PCa患者分为GLDC-高组和GLDC-低组。首先，两组489例TCGA患者间鉴定出17159个差异表达基因（DEGs），最终鉴定出133个生化复发相关基因。随后，将这些生化复发相关基因与GEO数据集相交，并在TCGA和GEO队列中成功鉴定了22个生化复发相关基因。通过应用LASSO Cox回归分析，基于这22个基因，使用最优γ值构建了风险模型（图5A）。此外，通过运行公式计算了这22个生化复发相关基因的风险评分。根据中位风险评分，客观地将TCGA队列和GEO队列的PCa患者分为HR组和LR组。
此外，生存分析表明，与LR组相比，HR组的PFS和OS生化复发率更高，生存概率更低（图5B-D）。此外，发现风险评分与患者的生存状态和生存时间密切相关（图5G）。通过ROC分析证明了本模型对生化复发的预测能力，1年、3年、5年的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.836、0.899和0.914（图5F）。同样，PFS的AUC值在1年时为0.968,3年在时为0.906，在5年时为0.879（图5E）。然后，将临床特征与风险评分相结合，进行单因素和多因素Cox回归分析，结果显示风险评分是PCa患者预后的独立危险因素（图5H，I）。
接下来，研究了TCGA队列的临床特征与风险组之间的联系，发现两个风险组在临床T分期、Gleason评分、病理T分期、病理N分期、治疗成功率和结局成功率方面存在显著差异（图5J）。具体而言，HR组临床特征较差（临床T分期、Gleason评分、病理T分期、病理N分期、治疗成功率和结局成功率）的患者比例高于LR组；换言之，临床参数较差的患者风险评分较高，详情如图所示，图5K-P。此外，发现在不同的临床亚组中，HR组的总生存率均差于LR组，详情如图所示，图6A-R。在GEO队列中，还发现，临床特征（如Gleason评分、阳性手术切缘和生化复发）与风险评分显著相关。具体而言，与LR组相比，HR组的Gleason评分较差、手术切缘阳性且生化复发的可能性更高。同样，在不同的临床亚组中，HR组的总生存率均差于LR组，详情见补充图3E-N。基于这些结果，基于GLDC的风险模型可以较好地预测PCa患者的临床特征和生存率。
为了进一步研究GLDC对前列腺癌转移的影响，通过将siRNA转染到DU145和LNcap细胞中来下调GLDC的表达（图7A），结果显示，与对照组相比，si-GLDC组的迁移和侵袭能力显著降低（图7B、C）。接下来，通过将GLDC过表达质粒转染到22RV1细胞中来上调GLDC的表达（图7A）7A）发现，与对照组相比，p-GLDC组的迁移和侵袭能力显著提高（图7D、E）。将野生型GLDC质粒和变异型MT-GLDC质粒转染到22RV1细胞中后，发现p-GLDC组和p-MT-GLDC（GLDC过表达但酶失活）组的GLDC表达均显著增加（图 7F）。然而，p-GLDC组的迁移和入侵能力显著提高，而p-MT-GLDC组的迁移和入侵能力没有显著提高（图7G，H）。这些结果表明，GLDC和酶活性在前列腺癌体外侵袭和转移中起着重要作用。
为了便于评估体内癌症进展，将转染GLDC慢病毒（p-GLDC组）、点突变型GLDC慢病毒（p-MT-GLDC组）和空载体（p-NC组）的22RV1细胞分别注射到小鼠前列腺中。所有注射GLDC慢病毒的小鼠（n = 5）都发生了转移，而注射MT-GLDC慢病毒的5只动物中有3只（60%）和注射空载体的5只动物中有4只（80%）没有发生转移。p-GLDC组肿瘤比p-MT-GLDC组和p-NC组肿瘤具有更高的光子通量（图7I，7J）。既往研究表明，转移性前列腺癌患者的器官分布呈异质性，包括肺、肝、肾和骨骼。研究表明，GLDC显著促进了多个器官的转移性病变，最常见于近端和远端淋巴结，其次是肺、肝、肾、胰腺和睾丸，而p-MT-GLDC组和p-NC组则没有（图7K，L）。这些结果表明，GLDC和酶活性对于前列腺癌在体内的侵袭和转移至关重要。
首先，根据TCGA数据集中的基因表达水平，将473例PCa患者分为GLDC高组和GLDC-低组。为了评估两组基因突变状态的差异，使用Maftools对这些PCa患者的全基因突变进行了鉴定，突变率最高的前20个基因分别显示在GLDC-高组和GLDC-低组（图8A-B）。与GLDC低组相比，GLDC高组的总突变频率更高（55.75% vs 52.5%）。此外，TP53在GLDC高组的突变率高于GLDC低组（11% vs 9%）。然而，GLDC低组的基因SPOP突变率高于GLDC高组（11% vs 8%），这可能归因于遗传异质性。这些基因的突变可能部分解释了GLDC高组预后较差的原因。接下来，探索了两组的功能或通路，结果显示，KEGG通路在癌症、KEGG细胞周期、gobp蛋白靶向、gocc线粒体基质、gobp小GTP酶介导的信号转导等中，GLDC高组比GLDC-低组更富集（图8C-D），这些证据可能揭示前列腺癌GLDC预后不良的潜在机制。
然后，进一步探究GLDC与免疫微环境的关系，结果显示，与GLDC-low组相比，GlDC-high组的功能性免疫细胞浸润（CD8+ T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞等）较低，免疫抑制细胞浸润或功能（Treg细胞、T细胞共合抑制、APC共合等）较高（图8E-F）。此外，发现GLDC与免疫抑制基因（TGF-β、IL-10、VTCN1、CSF1R等）之间存在良好的正相关关系，GLDC高组的免疫检查点（PDCD1、CTLA-4、CD274）高于GLDC-低组（图8G，J-L）。此外，GLDC高组的免疫排斥评分和MDSC水平也高于GLDC低组（图8H）。这些发现表明，在PCa患者中，GLDC高组可能遭受更高的免疫逃逸风险。
