今天小编和大家分享一篇2023年2月发表在Journal of translational medicine.（IF:6.1）期刊的文章《Role of mitochondrial metabolic disorder and immune infiltration in diabetic cardiomyopathy: new insights from bioinformatics analysis》。
糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病常见的心血管并发症之一，也是糖尿病患者死亡的主要原因。线粒体代谢和免疫炎症是DCM发病机制的关键，但它们在DCM中的串扰仍然是一个悬而未决的问题。本研究探讨了线粒体代谢和免疫微环境的不同作用及其在DCM与生物信息学中的串扰。DCM芯片数据（GSE4745、GSE5606和GSE6880）从NCBI GEO获得，而线粒体基因数据从MitoCarta3.0数据库下载。通过GEO2R筛选差异表达基因（DEGs）并处理用于GSEA、GO和KEGG通路分析。获得线粒体相关DEGs（MitoDEGs）。构建PPI网络，并通过CytoHubba、MCODE和CTD评分确定与DCM或心力衰竭密切相关的枢纽MitoDEGs。分别用Cytoscape和miRWalk数据库预测枢纽MitoDEGs的转录因子和靶标miRNA，并建立调控网络。使用ImmuCellAI分析DCM中的免疫浸润模式，而使用Spearman方法研究MitoDEGs与免疫浸润丰度之间的关系。建立DCM大鼠模型以验证枢纽MitoDEGs的表达及其与心脏功能的关系。DCM中的MitoDEGs在参与线粒体代谢、免疫调节和胶原蛋白合成的通路中显著富集。获得9个与DCM或心力衰竭密切相关的枢纽MitoDEGs。免疫分析显示DCM免疫微环境中B细胞浸润显著增加，同时DC浸润减少。Spearman分析表明，枢纽MitoDEGs与促炎免疫细胞的浸润呈正相关，但与抗炎或调节免疫细胞的浸润呈负相关。在动物实验中，4个中心MitoDEGs（Pdk4、Hmgcs2、Decr1和Ivd）的表达趋势与生物信息学分析结果一致。此外，Pdk4、Hmgcs2、Decr1的上调和Ivd的下调与心功能降低明显相关。
背景
随着生活方式的改变，糖尿病（diabetes mellitus，DM）的发病率呈迅速上升的趋势。据国际糖尿病联合会估计，到2030年，糖尿病患者人数将增加到5.784亿，发病率高达10.2%。与健康人相比，DM患心力衰竭（heart failure，HF）的风险增加了2-4倍，因此它往往会导致非常不良的预后。糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy，DCM）是DM的严重心血管并发症之一，由S Rubler于1972年首次报道。它在病理生理学上是多因素的，尚未得到充分探索。
越来越多的研究指出，导致损伤和功能障碍的线粒体事件，包括异常动力学、线粒体自噬、钙稳态失衡、能量代谢紊乱和氧化应激，在DCM中起着至关重要的作用。此外，脂质中间代谢物的过度积累被认为与糖尿病心肌的毒性损伤和功能障碍直接相关。已经确定，心肌组织中炎症过程的免疫浸润和激活也是DCM的关键病原体。例如，1型和2型DM模型都增加了单核细胞和巨噬细胞的心肌浸润；慢性高血糖通过RAGE依赖性途径激活T细胞，诱导Th1、Th2和Th17细胞因子升高；此外，高葡萄糖环境还可以激活肥大细胞并诱导促炎介质的释放，从而导致DCM的病理重塑加剧。
有趣的是，越来越多的证据表明，免疫与线粒体代谢之间存在潜在联系，代谢状态可以通过改变免疫微环境来影响炎症的发展。典型的T细胞活化伴随着胰岛素受体和糖酵解酶的上调。高水平的胰岛素可以损害调节性T细胞（Tregs）的功能，并通过调节AKT/mTOR信号通路抑制其对炎症反应的抑制功能。线粒体代谢和免疫炎症都是DCM的关键病原体，但它们在DCM中的串扰尚未报道，需要进一步探索。
生物信息学允许从在多个层面上变化的微阵列数据中筛选显示患者和健康个体之间差异的分子。它被认为是探索疾病潜在分子机制的有效研究方法。通过这种方法，目前的研究基于来自GEO数据库（GSE4745、GSE5606和GSE6880）的相关微阵列数据分析了线粒体相关基因如何促进DCM的发育并与免疫浸润相关。此外，还研究了枢纽线粒体相关基因与DCM中免疫浸润之间的关系，以帮助更好地了解疾病发展过程中的潜在免疫代谢。
方法
（1）DCM差异基因获取
（2）功能富集分析
（3）线粒体相关DEG的鉴定
（4）蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析和Hub基因鉴定
（5）CTD数据库检索与DCM和HF相关的基因
（6）Hub基因-转录因子（TF）-miRNAs网络预测
（7）免疫浸润分析
（8）DCM动物模型构建
（9）超声心动图
（10）RNA 提取和 qRT-PCR
（11）Western blotting
（12）免疫组化
（13）Hub基因与心脏功能的相关性
（14）统计分析
结果
（一）差异表达分析及功能富集分析
获取GSE4745、GSE5606和GSE6880三个DCM相关GEO数据集进行分析。差异分析显示GSE4745数据集中有293个DEGs，与正常样本相比，DCM样本中有149个基因上调，144个基因下调；GSE5606数据集中有544个DEGs，包括269个上调和275个下调基因；和GSE6880数据集中的463个DEGs，包括262个上调和201个下调基因。DEG被可视化为火山图和热图（图1a-f）。
GSEA显示，3个数据集的DEGs主要参与脂质和脂肪酸代谢以及免疫相关的途径，包括脂质代谢、PPARα对脂质代谢的调节、脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、抗原加工和呈递、MHC II类抗原呈递、内源配体对TLR的调节、补体激活（图1g–n）。此外，它还显示参与胶原蛋白合成、胶原纤维组装和氧化应激的途径富集。
通过GO和KEGG通路分析进一步处理DEGs以进行功能富集。最丰富的GO术语分为生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF），主要包括线粒体功能和成分、能量代谢、炎症免疫、缺氧和氧化还原反应、胶原蛋白合成和胰岛素敏感性等（图2a-f）。DEGs最富集的KEGG通路以参与线粒体代谢和功能、缺氧和氧化还原反应、物质生成和免疫等的通路为主（图2g-l）。
（二）线粒体相关差异基因(MitoDEGs)的鉴定
从MitoCarta3.0数据库中检索线粒体相关基因，并从3个数据集中选取与DEGs重叠的基因作为MitoDEGs。在GSE4745数据集中，总共有32个MitoDEGs（15个上调和17个下调）（图3c），GSE5606数据集中的34个MitoDEGs（18个上调和16个下调）（图3d）和GSE5606数据集中的25个MitoDEGs（14个上调和11个下调（图3e）。将每个数据集的MitoDEGs合并，得到67个重叠的MitoDEGs，与正常样本相比，DCM样本中有35个基因上调，32个基因下调。
（三）PPI网络和枢纽 MitoDEGs鉴定
使用STRING数据库分析67个MitoDEGs的PPI，并将其可视化为带有Cytoscape的网络（图3f）。使用Cytoscape实施的插件MCODE鉴定重要模块（基因簇），过滤标准如下：度数截断=2；节点分数临界值=0.2；k核=2；最大深度=100。由9个节点和17个边缘组成的模块被鉴定为显著的，该模块中涉及的基因是Acsl6、Acadsb、Decr1、Ivd、Oxct1、Gpam、Pdk4、Hmgcs2和Acot2（图3g）。使用插件CytoHubba的MCC算法，从PPI网络中鉴定出10个候选枢纽基因，包括Cpt1a、Hsd17b4、Hmgcs2、Acadsb、Decr1、Acot2、GPAM、Oxct1、Acsl6和Ifd（图3h）。综合结果，最终获得11个枢纽MitoDEGs，包括Acadsb、Hmgcs2、Hsd17b4、Gpam、Acot2、Ivd、Decr1、Cpt1a、Acsl6、Oxct1和Pdk4。
（四）枢纽 MitoDEGs与DCM/HF之间的关系
应用CTD数据库预测枢纽MitoDEGs与DCM/HF之间的关系。经分析，Cpt1a、Gpam、Hmgcs2和Acadsb与DCM的相关性最高（图4a），而Cpt1a、Pdk4、Gpam和Hmgcs2与HF的相关性最高（图4b）。
（五）枢纽 MitoDEGs-TFs-miRNAs 调控网络
通过预测相关的TFs和miRNAs来探索枢纽MitoDEGs的上游调控。使用Cytoscape的插件iRegulon预测枢纽MitoDEGs的TFs，并构建一个由19个TFs（Rora、Maf、Ing4、Srebf2、Mafb、Zfp706、Pole3、Rreb1、Mybl2、Myb、Tcf4、Mafa、Cebpa、Thra、Pdcd11、Yy1、Runx2、Cdx1、Ubp1）组成的枢纽MitoDEGs-TFs调控网络（图4c）。使用miRWalk3.0预测枢纽MitoDEGs的miRNA，并生成一个涉及299个节点和569个边缘的枢纽MitoDEGs-miRNAs调控网络（图4d）。有3个miRNA，包括miR-298-5p，与Ivd、Acsl6、Acot2和Hmgcs2有相互作用；与Oxct1、Ivd、Cpt1a和Acsl6相互作用的miR-30c-1-3p；以及与Oxct1、Cpt1a、Acsl6和Hmgcs2相互作用的miR-344b-5p。但是，需要进一步验证。
（六）DCM中的免疫细胞浸润
使用ImmuCellAI算法分析36种免疫细胞类型的浸润，并在GSE5606和GSE6880数据集中比较DCM和CON组。DCM组和CON组在9种免疫细胞类型的心肌浸润方面存在显著差异（P<0.05）。具体来说，B细胞、边缘区B和记忆B在DCM组中更丰富，而粒细胞、树突状细胞、MoDC、cDC1、pDC和cDC2在CON组中更丰富（图5a-c）。对DCM中浸润免疫细胞的进一步分析表明，细胞之间存在多重相关性（图5d）。相关程度由分数表示。CD4T细胞和初始CD4T之间的协同效应最强（0.99），其次是CD4T细胞和辅助性T细胞（0.98），CD8Tcm和CD8Tex（0.98），初始CD4T和T辅助细胞（0.97）。相比之下，初始CD8T细胞和B细胞之间的竞争效应最强（-0.72），其次是pDC和边缘区B（-0.69），初始CD8T和记忆B（-0.69）。
（七）MitoDEGs/hub MitoDEGs与免疫细胞的关系
应用Spearman方法探讨MitoDEGs/hubMitoDEGs与免疫细胞之间的潜在关联。MitoDEGs（35个上调和32个下调）与免疫细胞之间的正/负关联如图6a-b。在11个枢纽MitoDEGs中，Pdk4与边缘区B呈正相关，但与cDC2、MoDC和pDC呈负相关;Oxct1与pDC和CD8Tem呈正相关；Ivd与CD8Tem呈正相关；Hsd17b4与边缘区B和M2巨噬细胞呈正相关，与cDC2、MoDC和pDC呈负相关；Hmgcs2与边缘区B、M2巨噬细胞呈正相关，但与粒细胞和cDC2呈负相关；GPAM与树突状细胞、粒细胞、cDC1和MoDC呈负相关；Decr1与边缘区B和M2巨噬细胞呈正相关，而与粒细胞、cDC2和pDC呈负相关；Cpt1a与树突状细胞、cDC1、MoDC和pDC呈负相关；Acsl6与pDC、嗜酸性粒细胞和CD8Tem呈正相关；Acot2与树突状细胞和cDC1呈负相关（图6c）。
（八）DCM 大鼠的一般生物学和超声心动图特征
在建模过程中，DCM组高脂饮食喂养大鼠的体重显著高于CON组，并且从STZ注射后2周开始趋于下降，在组织取样前明显低于CON组（图7a）。STZ诱导1周后，DCM组血糖开始升高，在整个建模过程中血糖水平始终高于CON组（图7b）。超声心动图显示，与CON组相比，DCM组的EF%和FS%显著降低（P<0.05），但LVID显著升高（P<0.05）。此外，两组之间的LVIDd略有不同（图7c-h）。此外，与CON组相比，DCM组标准化为体重的心脏重量（HW/BW）和标准化为胫骨长度的心脏重量（HW/TL）显着增加（P<0.05，图7i-j）。
（九）枢纽 MitoDEGs 在 DCM 大鼠中表达的实验验证
在qRT-PCR大鼠中验证了9个枢纽MitoDEGs（Acadsb、Acot2、Cpt1a、Decr1、Gpam、Hmgcs2、Hsd17b4、Ivd和Pdk4）的心室表达。与CON组相比，DCM组Pdk4、Hmgcs2和Decr1的表达显著增加（P<0.05），而Ivd在DCM组中的表达显著降低（P<0.05）（图7k）。之后，我们通过western blotting和免疫组化进一步验证了DCM和CON组之间Pdk4、Hmgcs2、Decr1和Ivd的蛋白表达。结果显示，Pdk4、Hmgcs2、Decr1和Ivd的蛋白表达水平与mRNA一致（P<0.05）（图7l-n）。
（十）枢纽 MitoDEGs与心脏功能的关系
进一步分析了DCM组和CON组之间表达差异显著的4个枢纽MitoDEGs（Pdk4、Hmgcs2、Decr1和Ivd）与EF、FS%和LVID的相关性。Pdk4的PCR循环数与EF%呈极显著正相关（R=-0.904;P=0.002）和FS%（R=0.934;P<0.001），但与LVID呈极显著负相关（R=0.852;P=0.007）；Hmgcs2的PCR循环数与EF%呈极显著正相关（R=0.782;P=0.022）和FS%（R=0.812;P=0.014）；Decr1的PCR循环数与EF%呈极显著正相关（R=0.829;P=0.011）和FS%（R=0.801;P=0.017）；lvd的PCR循环数与EF%呈极显著负相关（R=-0.978;P<0.001）和FS%（R=-0.943;P<0.001），但与LVID呈极显著正相关（R=0.852;P=0.007）（图7o）。总的来说，DCM心肌组织中Pdk4、Hmgcs2和Decr1的表达上调以及Ivd表达下调与心脏功能的降低高度相关。
