大家好！今天小编和大家一起分享一篇2024年10月发表在Ecotoxicol Environ Saf杂志的文章Elucidating the mechanism of plasticizers inducing breast cancer through network toxicology and molecular docking analysis:
背景
增塑剂(Plasticizers)是一类广泛用于增强塑料产品的柔韧性和可加工性的化学添加剂。其中，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)和邻苯二甲酸二辛酯(DOP)是最常用的化合物。不可否认，它们在我们的日常生活中无处不在，从个人护理产品和塑料玩具到医疗设备和外卖包装，它们随处可见。这种普遍性使得人类接触这些物质几乎是不可避免的。然而，这些化合物的亲脂性和环境稳定性不仅有利于它们的广泛应用，而且有助于它们在人体和环境中的持久性和生物累积性。这些特征引发了关于其潜在内分泌干扰特性和长期健康影响的科学辩论。
乳腺癌(Breast cancer)是全球女性中发病率最高的恶性肿瘤之一，其发生受到遗传、生活方式和环境因素的复杂相互作用影响。乳腺癌发病率的上升部分归因于环境因素，长期暴露于包括增塑剂在内的化学物质被怀疑可能起到促进作用。流行病学研究强调了在关键发育时期如青春期接触某些化学物质会提高患乳腺癌的风险。随着暴露评估技术的进步，科学界现在能够更好地评估增塑剂暴露与乳腺癌之间的复杂关系，为潜在风险提供更精确的见解。
为了应对这种日益增长的担忧，当前的研究旨在采用网络毒理学和分子对接技术来研究常见增塑剂(DEP、DMP和DOP)与乳腺癌相关关键蛋白之间的分子相互作用。网络毒理学是一种融合了生物信息学、系统生物学和化学信息学的跨学科方法，提供了一个全面的框架来理解化学品如何干扰生物分子网络和破坏细胞功能，从而潜在地导致疾病。另一方面，分子对接在原子水平上模拟了增塑剂与蛋白质的复杂结合模式，阐明了这些化学物质可能导致癌症发病的潜在机制途径。通过整合这些先进的方法，这项研究试图揭示每天接触增塑剂如何影响乳腺癌的发生和发展的分子基础。这项研究不仅旨在为增塑剂的安全评估提供新的见解，还旨在促进乳腺癌预防策略的发展，利用协同给药策略中不同模式的组合潜力来增强治疗效果。
材料与方法
本研究中使用的所有数据库资源，连同它们的访问链接，已经合并到补充文件1中。图1展示出了详细描述研究过程的流程图。
图1：本研究的工作流程
1.增塑剂中常见化学成分的获取
关于增塑剂的常见化学成分的信息是通过PubMed、谷歌学术和ToxNet等数据库获得。
2.增塑剂的毒性研究
使用PubMed、谷歌学术、中国国家知识基础设施(CNKI)和ToxNet等数据库进行文献搜索，以检索与增塑剂相关的疾病信息，特别关注与乳腺癌相关的疾病。
3.化学成分目标的获取
从PubChem数据库中检索增塑剂主要成分的SMILES结构。在ChEMBL、STITCH、PharmMapper和DrugBank等数据库中搜索这些成分的靶标，将靶标生物设置为智人。SMILES结构被传送给STITCH以获取补充信息。使用PharmMapper进行目标预测。使用Uniprot数据库执行名称标准化，合并五个来源的结果并分别进行重复数据删除。
4.疾病相关目标的获取
乳腺癌相关靶基因从Genecards和OMIM等数据库下载。然后确定了与乳腺癌相关的靶标与增塑剂的主要化学成分靶标的交集，作为增塑剂诱发乳腺癌的毒性的潜在靶标。
5.蛋白质相互作用网络的构建及富集分析
利用STRING构建乳腺癌、增塑剂相关疾病、增塑剂主要成分靶基因之间的关系网络。导出数据文件，然后使用Cytoscape可视化，以建立蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。使用Clusterprofiler和ClueGO进行富集分析。
6.核心目标筛选
为了识别蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络中的关键基因，我们的研究使用CentiScaPe 2.2插件计算网络指标，然后进行排序和标准化过程。这种方法的详细描述如下:
6.1 使用CentiScaPe 2.2进行网络分析
使用CentiScaPe 2.2和ClueGO插件分析PPI网络，这有助于计算网络中每个蛋白质的各种中心性指标，即度、介数和应力中心性。
6.2 排名和标准化
排名:每个基因的程度、中间值和压力中心值被排名。排序过程基于每个中心性度量给每个基因分配一个等级，其中等级越低表示中心性值越高。通过将最低可能等级分配给并列值来处理并列。标准化:然后将每个中心性度量的等级标准化为从0到1的等级。这是通过从每个等级中减去为该度量观察到的最小等级，然后除以该度量的等级范围(最大等级-最小等级)来实现的。标准化等级的重新排序:标准化后，标准化等级本身按照与初始排序相同的程序再次排序。平均标准化等级的计算:对于每个基因，平均标准化等级是通过将其在三个中心性度量中的标准化等级平均来计算的。这一步将中心性度量结合成一个单一的合成分数，反映了网络中每个基因的整体重要性。
关键基因的识别:然后根据基因的平均标准化等级降序排列基因，优先考虑具有最高综合中心性分数的基因。选择前20个基因进行进一步研究，由于它们在网络中的重要作用而被确定为关键基因。
7.TCGA乳腺癌关键基因表达分析
为了定量分析乳腺癌组织中六个关键基因(ALB、AKT1、EGFR、ESR1、SRC、MAPK1)相对于正常对照组织的差异表达，使用来自TCGA乳腺癌队列的RNA-seq FPKM-UQ数据。使用R package ggplot2构建基因表达的小提琴图，以表示不同样品类型中每个基因表达水平的分布。数据处理包括读取标准化基因表达数据和临床表型信息。只有归类为“原发性肿瘤”和“正常实体组织”的数据被保留用于比较，Wilcoxon秩和检验用于评估这两种样本类型之间表达水平的差异。
8.分子对接
使用分子对接技术探索增塑剂的三种化学成分和关键基因之间的潜在结合。AutoDock Vina用于对接过程，PyMOL用于可视化。从PDB检索关键基因的pdb文件，然后用AutoDock Vina对接，用PyMOL可视化。使用在线工具NovoPro将来自PubChem的配体SMILES文件转换成pdb格式。
结果
1.三种增塑剂的化学信息
三种增塑剂的化学细节在补充文件2中给出，包括它们的化学式、分子量和SMILES结构。
2.增塑剂的毒理学研究
使用多个数据库进行了全面的文献搜索，以检索与增塑剂相关的疾病的相关信息。对与乳腺癌有关的疾病给予了特别关注。
3.三种化学成分的靶基因
在对从多个数据库中获得的数据进行整合和去重复后，在所有三种增塑剂成分中总共鉴定出311种独特的目标蛋白质。具体来说，发现DEP靶向288种蛋白质，而DMP靶向129种蛋白质，DOP靶向92种蛋白质。有趣的是，一项比较分析揭示了所有三种增塑剂组分共有的一组32种目标蛋白。这些确定的目标蛋白代表了潜在的分子目标，通过这些目标，暴露于增塑剂可能会产生毒理学效应，包括乳腺癌发展的风险。对这些目标蛋白的进一步研究和验证可能有助于更好地理解潜在的机制，并有助于为减轻与增塑剂暴露相关的不良健康影响的策略提供信息。
图2：三种化学成分及其靶基因之间的关系图。橙色矩形代表三种化学成分，蓝色圆圈代表其相应的靶基因。
4.乳腺癌相关靶基因的鉴定
共检索到6812个乳腺癌相关靶基因。这些基因与增塑剂的主要化学成分的目标基因的交叉产生了235个基因，如图3所示。这235个基因代表了与增塑剂诱发的乳腺癌相关的潜在靶点。需要进一步的研究来阐明这些基因在乳腺癌发生中的特殊作用，并探索它们作为增塑剂暴露相关乳腺癌风险评估的治疗靶点或生物标志物的潜力。
图3：三种化学成分与乳腺癌相关基因的靶点交集
5.目标基因的富集分析
图4A展示了全面富集分析的结果，突出了与一组参与乳腺癌的基因相关的重大生物学主题。在生物过程类别中，数据显示了诸如细胞内受体信号传导和激素介导的信号通路等过程的显著富集，这些都是调节细胞对外部刺激反应的关键。分子功能分析突出了涉及结合活动的基因的过度代表，包括蛋白酪氨酸激酶活性，已知其在调节细胞增殖和存活的信号通路中发挥关键作用。细胞组分富集强调了诸如细胞质囊泡腔和膜小丘等组分，这些组分对于细胞转运和信号转导至关重要。此外，KEGG通路分析表明，与癌症相关的通路（如PI3K-Akt信号通路）显著富集，该通路因其在包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成在内的多种细胞功能中的作用而闻名。
图4：GO和KEGG的富集结果。（A）柱状图显示了与乳腺癌相关基因相关的显著富集的生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组分（CC）以及KEGG通路。（B）点阵图展示了在富集的GO术语和KEGG通路中排名前20的基因频率。每个点代表相应富集术语中存在的基因。
6.蛋白质相互作用网络的构建及核心靶标的筛选
PPI网络的径向布局如图5A所示。节点(基因)根据其由复合中心性测量确定的等级组织成同心圆。最里面的圈由前20个基因组成。图5B说明了前20个基因的程度和应力中心性测量之间的关系。每个点代表一个基因，其沿x轴的位置反映程度中心性，沿y轴的位置指示应力中心性。点的颜色强度或大小可以对应于应力值的大小，更强或更大的点表示更高的应力集中性。图4B展示出了前20个基因出现在丰富术语中的频率。该点状图揭示了基因术语关联的模式，其中某些基因在多个富集类别中重复出现，表明它们在乳腺癌病理生物学中的多方面作用。图6显示了从我们的数据集中鉴定的前20个基因的网络分析，强调了它们在与乳腺癌相关的信号通路和生物学过程中的作用。该分析采用了ClueGO + CluePedia工具套件来阐明核心基因和特定途径之间的关系。从该分析中出现了四个中心基因(MAPK1、AKT1、SRC和ESR1 )显示了与VEGF信号通路、催乳素信号通路和乳腺上皮发育的生物学过程的连接性。网络可视化显示了这些基因和途径之间关联的频率和强度，节点大小对应于网络中每个基因的连接数。因此，这四个基因，AKT1，ESR1，SRC和MAPK1，加上排名第一的ALB，构成了我们研究中确定的关键基因。
图5：基于中心性的层次化可视化在蛋白质-蛋白质相互作用网络中的关键基因。
图6：乳腺癌相关途径核心基因的网络分析。
7.TCGA乳腺癌关键基因的表达结果
如图7所示，结果表明，在原发性肿瘤样本和正常组织样本中，所有基因的表达水平存在显著差异。值得注意的是，ALB和ESR1在肿瘤组织中的表达水平显著降低，而AKT1、EGFR、SRC和MAPK1则显著上调。这些发现表明，这些基因可能在乳腺癌的发生机制中发挥作用，特定基因在肿瘤条件下的下调或上调模式保持一致。
图7：TCGA乳腺癌中关键基因的表达
8.分子对接的结果
AKT1、ESR1、SRC、MAPK1和排名最高的ALB基因分别用三种类型的增塑剂进行了分子对接模拟。最可能的结合构象如图8，11，12所示。红色、蓝色和绿色配体分别代表DEP、DMP和DOP。图8显示了SRC与三种增塑剂的对接结果，揭示了DEP和DMP与SRC上的相同位点结合，特别是与苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)残基结合。这可能意味着在分子水平上，DEP和DMP具有相似的潜在生物学效应，而DOP结合到赖氨酸残基上的另一个位点。相互作用包括氢键和疏水相互作用，突出了这些位点的多功能结合性质。ESR蛋白与增塑剂的对接结果如图9所示，其中DEP和DOP结合到相同的位点，而DMP结合到不同的位点。这表明在共同的结合位点存在氢键和可能的π-π堆积相互作用，表明了一种联合作用模式。图10显示了三种增塑剂与MAPK1的对接结果。可以看出，这三种分子与MAPK1上的不同位点结合。结合涉及氢键、疏水相互作用和潜在静电相互作用的组合，表明位点特异性结合特性。
图11证明了三种增塑剂分子可以与AKT1蛋白上的相同结合位点相互作用，表明该位点对此类化合物具有一定的结合特异性。相互作用主要包括氢键和范德华力，突出了结合的特异性和稳定性。ALB与增塑剂的对接结果显示在图12中，显示尽管它们结合到不同的位点，但它们都可以通过氢键与ALB的不同残基相互作用。DEP与Thr残基形成两对氢键。另一方面，DMP与ALB的精氨酸(Arg)和酪氨酸(Tyr)残基上的三个不同位点结合。DOP与组氨酸(His)和Arg残基形成两对氢键。虽然这三种增塑剂与不同的位点结合，但它们都可以通过氢键与ALB相互作用。这表明ALB对不同的增塑剂具有广泛的结合能力，这可能与其作为参与体内多种小分子转运的主要血浆蛋白的作用相关。
图8：SRC分子对接与增塑剂DEP、DMP和DOP。红色、蓝色和绿色配体分别代表DEP、DMP和DOP。
图9：ESR1与增塑剂DEP、DMP和DOP的分子对接。
图10：MAPK1与增塑剂DEP、DMP和DOP的分子对接。
图11：AKT1与增塑剂DEP、DMP和DOP的分子对接。
图12：ALB与增塑剂DEP、DMP和DOP的分子对接。
讨论
增塑剂，如DEP、DMP，是普遍存在的化学添加剂，用于增强塑料材料的柔韧性和可加工性。它们的广泛应用范围从个人护理产品到医疗器械和食品包装，导致人类和环境的普遍接触。尽管这些化合物在材料科学中具有功能性益处，但其亲脂性和环境持久性引起了人们对其在生物系统中的累积和潜在内分泌干扰作用的担忧。值得注意的是，长期接触增塑剂与乳腺癌(全球女性中最常见的恶性肿瘤之一)发病率之间的联系引起了科学界的极大兴趣。流行病学和实验研究表明，接触某些化学品，包括增塑剂，特别是在发育的关键时期，如青春期，可能会增加乳腺癌风险。然而，这种联系的分子机制仍然知之甚少。在此背景下，本研究旨在利用网络毒理学和分子对接技术阐明DEP、DMP和DOP对乳腺癌分子发病机制的影响。我们使用网络分析确定与增塑剂相互作用的关键蛋白质，这种方法使我们能够研究增塑剂与乳腺癌相关的蛋白质的结合亲和力。网络毒理学整合了生物信息学、系统生物学和化学信息学，以揭示化学物质如何干扰生物网络并影响细胞功能，从而可能导致疾病。另一方面，分子对接模拟了增塑剂与蛋白质靶标在原子水平上的相互作用，为潜在的致病机制提供了见解。通过这种联合方法，我们的研究旨在为评估增塑剂的安全性及其在乳腺癌发展中的作用提供新的科学证据，并为更广泛的关于环境和健康的讨论做出贡献。分子对接的应用进一步揭示了特定的相互作用，这些相互作用可能是流行病学数据中观察到的关联的基础，非常类似于在参考的阿尔茨海默氏病研究中看到的隐脑啡肽和核黄素的详细相互作用分析。相互作用距离在分子对接研究中起着至关重要的作用，包括键距离，这对于理解这些相互作用的稳定性和特异性至关重要。
富集分析已经确定了在乳腺癌进展中起关键作用的五个关键基因:MAPK1、AKT1、SRC、ESR1和ALB。MAPK1作为细胞生长和分化的中枢调节因子，由于其在细胞信号通路中的作用，已经与各种癌症类型有关。这种基因与癌症的关系突出表现在它对耐药机制的贡献以及代谢和表观遗传异常的调节，提供了新的治疗机会。类似地，AKT1在细胞存活信号传导中的核心作用得到了充分的证明，其过度活性经常在癌细胞中观察到，这表明其作为治疗靶点的潜力。SRC是一种原癌基因，参与控制细胞增殖的途径，进一步强调了这些信号通路在癌症发展中的相互联系。在这些相互作用中观察到的特定键距离为形成的复合物的结合亲和力和稳定性提供了关键的见解，突出了这些分子细节在理解蛋白质-配体相互作用中的重要性。SRC与催乳素信号通路的连接为乳腺癌信号网络增加了另一层复杂性。考虑到SRC已知的致癌潜力及其在细胞生长和分化中的参与，我们的发现可能表明SRC通过调节催乳素信号在乳腺癌中发挥作用的一个新方面。催乳素对乳腺及其发育有多种影响，SRC和该途径之间的相互作用可以为乳腺癌的激素调节提供新的见解。
雌激素受体ESR1在乳腺癌生物学中起重要作用，特别是在激素反应性癌症中。此外，ESR1在乳腺发育中的关键作用及其与乳腺癌病因学的既定联系与网络分析结果一致。雌激素受体通过各种信号通路的调节，包括我们研究中确定的信号通路，强调了激素驱动的乳腺癌发病机制的多面性和靶向干预的潜力。增塑剂与ESR1的相互作用及其在乳腺癌进展中的影响强调了对这些机制进行更深入理解的必要性。ALB虽然传统上与癌症信号通路无关，但从这项分析来看，它在乳腺癌中具有潜在的重要意义。它对不同增塑剂的广泛结合能力表明其在体内运输小分子中的作用，这可能是理解内分泌干扰物对癌症进展的系统性影响的关键。
这些发现共同指出了一个复杂的信号通路网络，涉及MAPK1、AKT1、SRC、ESR1和ALB在乳腺癌中的作用。它们在细胞过程中的作用，如增殖、存活和转移，以及外部因素如增塑剂的影响，提供了癌症生物学的多方面视角。这强调了在这些途径中靶向治疗的重要性，可能为乳腺癌带来更有效的治疗方法。考虑到这些基因及其通路之间的相互作用深度，特别是考虑到键距，为研究提供了有希望的途径，并强调了新型治疗干预的潜力。通过TCGA乳腺癌数据库分析证实的网络模型揭示了关键基因在肿瘤组织与正常对照之间存在显著差异表达，这印证了它们在肿瘤发生中的作用。这种差异表达突显了这些基因作为乳腺癌生物标志物的潜力，并强化了它们作为治疗干预目标的适用性。
正如我们的富集分析所揭示的，MAPK1和AKT1与VEGF信号通路的交叉与以前的发现一致，这些发现强调了这些激酶在血管生成和癌细胞增殖中的作用。VEGF通路对脉管系统重塑和肿瘤微环境的影响表明，MAPK1和AKT1可能调节乳腺癌生物学的这些方面，有可能作为生物标志物或治疗靶点。
分子对接的发现表明，增塑剂分子与关键靶位发生特定的相互作用，包括MAPK1，AKT1，SRC，ESR1和ALB，这些对乳腺癌细胞的功能至关重要。观察到的结合相互作用包括氢键和疏水相互作用，特定的键距离在稳定这些相互作用中起着关键作用。这些增塑剂与MAPK1和AKT1的结合可能会改变细胞分裂和存活所必需的信号通路，导致异常的细胞增殖。与SRC的相互作用可以改变激酶活性，影响细胞生长和转移潜力，而与ESR1结合可能破坏激素调节的基因表达，影响激素依赖性乳腺肿瘤的生长。具体来说，在结合位点识别的氢键和疏水相互作用，以及它们的距离，对于稳定配体和蛋白质复合物，促进它们的生物效应是至关重要的。此外，与ALB(一种负责运输各种内源性和外源性物质的蛋白质)的关联表明了这些增塑剂的全身分布机制，这可能进一步放大它们对乳腺癌细胞行为的影响。这些相互作用强调了一种潜在的机制，通过这种机制，增塑剂可能通过改变关键的细胞途径和功能而促成乳腺癌的分子病因学。此外，富集分析表明，增塑剂与许多腺癌有关，这可能是因为它们能够干扰内分泌信号通路和基因表达。这些化合物可以模拟或破坏激素功能，这在各种激素依赖性癌症的发展和进展中是至关重要的。这些结果强调了理解环境化学物质对致癌作用的分子影响的重要性，特别是在激素反应组织中。
这项研究阐明了增塑剂可能影响对维持细胞完整性和功能至关重要的途径。鉴于这些相互作用有可能扰乱内分泌功能和改变基因表达模式，旨在减少增塑剂暴露的策略可以大大有助于降低乳腺癌风险，并作为现有治疗方法的辅助手段。
结论
总之，这项研究揭示了增塑剂和乳腺癌之间的潜在机械联系，为环境健康科学和公共卫生政策提供了具有深远影响的新见解。通过整合网络药理学、蛋白质相互作用和分子对接，我们的研究提供了对DEP、DMP和DOP如何影响乳腺癌进展的全面理解。这些发现强调了重新评估常用增塑剂安全性的必要性，并强调了减轻乳腺癌全球负担的可能干预策略。我们希望这些结果将刺激对导致乳腺癌病因学的环境因素的进一步调查，并促进更有效的预防和治疗策略的发展。