今天小编和大家分享一篇2025年2月发表在Front Immunol（IF:5.7）期刊的文章《An integrative analysis of ASCL1 in breast cancer and inhibition of ASCL1 increases paclitaxel sensitivity by activating ferroptosis via the CREB1/GPX4 axis》。
之前的研究发现，Achaete-scute 复合同源物 1 (ASCL1) 在乳腺癌（Breast Cancer, BC）亚型的分类中起作用，并与不同的预后特征和病理特征相关。然而，ASCL1 在乳腺癌中的生物学作用仍未被充分探索。本研究旨在通过生物信息学分析以及体外和体内实验方法来阐明 ASCL1 在BC中的功能。本研究利用TCGA、GEO和Human Protein Atlas数据库来评估 ASCL1 在BC中的表达水平及其与患者预后的关联性。通过COSMIC和cBioPortal数据库评估 ASCL1 的遗传变异情况，并使用TIMER2.0数据库分析 ASCL1 表达水平与关键基因突变的关系。此外，GDSC 数据库用于分析 ASCL1 水平与标准化疗药物敏感性之间的关系。研究还探讨了 ASCL1 与 细胞因子、免疫调节因子、MHC 分子及受体之间的相关性，并采用 Pearson 和 Spearman 相关性分析进行统计评估。TIP 数据库用于评估 ASCL1 表达水平与免疫反应评分之间的联系，同时应用六种计算方法评估免疫细胞浸润情况。此外，在 MCF-7 和 MDA-MB-231 BC细胞系中进行了功能实验，并使用裸鼠模型进行了体内实验。研究发现 ASCL1 在BC中高表达，并与不良预后及关键癌基因突变相关。其表达水平与免疫调节因子、免疫细胞浸润及肿瘤微环境中的免疫反应评分相关。此外，ASCL1影响了肿瘤免疫动力学及化疗敏感性。ASCL1 过表达可增强BC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而ASCL1 的敲除则产生相反的作用。值得注意的是，ASCL1 的抑制可提高BC细胞对紫杉醇的敏感性，这一效应在体外和体内实验中均得到了验证。此外，ASCL1 抑制可激活BC细胞的铁死亡机制，表现为线粒体形态变化、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）水平升高、谷胱甘肽（GSH）水平降低及 GSH/GSSG 比率下降。在机制上，ASCL1 抑制降低了CREB1的磷酸化水平，从而减少GPX4的表达。ASCL1 在BC中具有致癌作用，并可能成为一种潜在的治疗靶点。
背景
BC是全球女性中最常见的恶性肿瘤。2022年，全球新增BC病例达到2,308,897例，其发病率仍在逐年上升。尽管目前已有多种治疗手段，包括手术、化疗、内分泌治疗、放疗、免疫治疗以及抗HER2治疗，BC仍然是女性癌症相关死亡的主要原因。因此，迫切需要新的治疗突破，以提高患者的生存率。
在癌症研究中，分子标志物可作为可测量的分子水平指标，辅助精准诊断、风险评估、治疗反应预测以及预后评估。此外，许多新型靶向治疗仅对携带特定基因突变的患者有效，因此分子标志物对于筛选这些特定患者群体至关重要。因此，发现高特异性和高敏感性的乳腺癌肿瘤标志物对于改善患者预后具有重要意义。
Achaete-scute 复合同源物 1（ASCL1）属于碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix, bHLH）家族的转录因子。ASCL1最早于20世纪80年代在果蝇中被鉴定为神经前体基因，因为它能够诱导未分化外胚层细胞向神经细胞分化。作为bHLH家族的关键成员，ASCL1在前脑发育过程中调控胶质细胞增殖，并决定神经元的表型和亚型。因此，ASCL1最初被认为主要与神经系统发育相关。
然而，在2014年，ASCL1被发现是高级别神经内分泌肺癌中的致癌基因，并被认为是一个潜在的治疗靶点。随后，越来越多的研究发现ASCL1过表达与多种癌症的致癌活性相关，且与不良预后及治疗耐药密切相关。例如，Miyashita N等研究表明，在肺腺癌中，ASCL1高表达的患者对免疫治疗的反应较差。同样，Wei J等研究发现，在小细胞肺癌患者中，ASCL1阳性患者的生存预后显著差于ASCL1阴性患者。此外，ASCL1过表达能够促进前列腺癌（prostate cancer）的进展和转移，而抑制ASCL1则可减少肿瘤细胞增殖。这些研究结果一致表明ASCL1在促进肿瘤进展中发挥重要作用。
除了促进多种癌症的发展外，ASCL1还被认为是SCLC亚型分类的分子标志物。2019年，Rudin等人提出基于四种转录因子（ASCL1、NeuroD1、YAP1和POU2F3）将SCLC分为A、N、Y、P四种亚型，这一分类方法促进了SCLC精准治疗的发展。目前，该分类标准已被广泛应用于SCLC研究。此外，团队的先前研究也表明，ASCL1是一个重要的染色质调控因子，可用于对不同预后及病理特征的BC亚型进行分类。这一发现提示ASCL1可能在BC中具有重要作用。然而，ASCL1在BC中的生物学功能仍然尚未充分研究。因此，开展了本研究。
本研究的目标是系统评估ASCL1在BC中的多重作用，重点探讨其在生物学过程、肿瘤免疫、治疗反应及预后中的影响。本研究结合生物信息学分析、体外实验和体内实验方法，进一步阐明ASCL1调控BC进展的分子机制，并评估其作为潜在治疗靶点的可能性。
方法
1.数据收集
2.差异表达分析
3.生存分析
4.遗传变异分析
5.免疫调节分析
6.免疫活性评分分析
7.免疫细胞浸润分析
8.药物敏感性分析
9.通路富集分析
10.细胞培养
11.慢病毒感染与细胞转染
12.细胞活力检测
13.克隆形成实验
14.伤口愈合实验
15.Transwell 侵袭实验
16.铁死亡指标检测
17.定量逆转录PCR
18.蛋白质印迹分析
19.免疫共沉淀
20.体内实验
21.统计分析
结果
（一） ASCL1 在BC中的高表达
本研究利用 TCGA 和 GTEx 数据库的联合数据分析了 ASCL1 在多种癌症类型中的 mRNA 表达水平，以弥补 TCGA 数据库中缺乏正常组织样本的问题。结果显示，ASCL1 在包括BC在内的多种癌组织中显著高表达（图 1A-B）。进一步，仅使用 TCGA 数据进行分析，发现 ASCL1 在BC组织中的表达仍明显高于正常组织，并通过配对分析得到了相同的结果（图 1C-D）。
进一步研究 ASCL1 的蛋白质表达水平也得到了相似的趋势。HPA 数据库的免疫组化数据显示，ASCL1 在正常乳腺组织中几乎检测不到（图 1E），而在BC样本中则呈现强阳性表达（图 1F）。Western blot 分析进一步证实了这一结果，显示 ASCL1 在BC细胞中的蛋白表达水平显著高于正常乳腺上皮细胞（图 1G）。这些结果一致表明 ASCL1 在BC中呈现高表达。
（二） ASCL1 与BC的不良预后相关
本研究进一步评估了 ASCL1 表达水平与BC患者预后的关系。结果表明，ASCL1 高表达的患者，其无复发生存期和总生存期均显著低于 ASCL1 低表达的患者（图 1H, I）。这些结果提示 ASCL1 可能在BC中发挥促癌作用。
（三） ASCL1 在BC中的基因变异情况
本研究利用 cBioPortal 数据库中 2051 例完整 DNA 测序的BC样本数据，分析了 ASCL1 在原发性BC中的突变频率和类型。此外，还分析了两个BC转移数据集，包括 481 例来自BC转移项目（The Metastatic Breast Cancer Project）的患者，以及 216 例来自 Lefebvre C 等人的研究，共 697 例转移性BC患者，以评估 ASCL1 在转移性BC中的突变频率和类型。
在原发性BC中，ASCL1 的突变频率为 0.4%（9/2051）（图 2A）。相比之下，在转移性BC中的突变频率显著升高至 5%（35/697），其中包括 14 例扩增、19 例深度缺失和 2 例错义突变。原发性BC与转移性BC组之间的突变频率差异具有统计学显著性（P < 0.001）（图 2B）。突变位点分析进一步揭示了 ASCL1 在转移性BC中的特定错义突变位点（图 2C）。
此外，本研究利用 COSMIC 数据库对 ASCL1 在BC中的突变情况进行了进一步分析。在 2779 例BC样本中，检测到 7 例 ASCL1 突变，包括 2 例同义突变、1 例移码插入、1 例移码缺失和 3 例其他突变类型（图 2D）。其中，两个同义突变均涉及 C>T 转换（图 2E）。
（四） ASCL1 与BC关键基因突变的相关性
本研究比较了 ASCL1 高表达组与低表达组BC患者的基因突变概况（图 2F）。分析结果表明，TP53、GATA3、PIK3R1、SMG1 和 UTP20 等多个关键基因的突变率在两组间存在显著差异。值得注意的是，与BC不良预后密切相关的 TP53 和 PIK3R1 突变率在 ASCL1 高表达组中显著升高，这提示 ASCL1 高表达可能与BC的进展相关。
（五） ASCL1 与免疫调节因子、免疫细胞浸润及免疫活性评分的关系
为了探究 ASCL1 高表达对BC的影响，本研究分析了 ASCL1 与肿瘤免疫的关系。肿瘤微环境在调控免疫应答方面发挥着重要作用，因此本研究在多种癌症（包括BC）中评估了 ASCL1 与细胞因子、免疫调节因子、主要组织相容性复合体分子及受体之间的关联。Pearson 和 Spearman 相关性分析均表明 ASCL1 在泛癌背景下与免疫调节因子密切相关（图 3A-B）。在BC中，ASCL1 表达水平与这些因子呈负相关。
进一步分析 ASCL1 与免疫细胞浸润的关系，采用六种不同的分析方法，将BC患者分为 ASCL1 高表达组和低表达组。结果显示，ASCL1 表达与多种免疫细胞类型相关，包括 B 细胞、调节性 T 细胞（Treg 细胞）、自然杀伤（NK）细胞、CD4+ 和 CD8+ T 细胞、M1 和 M2 巨噬细胞、髓系树突状细胞、中性粒细胞、单核细胞、内皮细胞和肥大细胞（图 4A-F）。值得注意的是，ASCL1 高表达组表现出 M2 巨噬细胞浸润增加，而 M1 巨噬细胞浸润减少。M2 巨噬细胞在恶性肿瘤中已被证实能够促进肿瘤进展并抑制免疫功能（图 4A），这些结果提示 ASCL1 可能在BC免疫逃逸过程中发挥作用。
然而，本研究还发现 ASCL1 对免疫应答的影响并不完全一致。例如，在 ASCL1 高表达组中，中性粒细胞的浸润减少，而 Treg 细胞、CD4+ 和 CD8+ T 细胞的浸润增加。通常情况下，中性粒细胞和 Treg 细胞被认为是促进肿瘤进展的细胞，而 CD4+ 和 CD8+ T 细胞则被认为是抑制肿瘤进展的细胞。这些结果似乎表明 ASCL1 介导的肿瘤免疫应答具有双重作用，但可以确定的是，ASCL1 与BC中的免疫细胞浸润密切相关。此外，本研究还评估了 ASCL1 表达水平与免疫反应评分的关系，结果表明 ASCL1 表达水平与BC的免疫反应评分相关（图 4G）。
（六） ASCL1 与BC的药物敏感性相关
基于上述研究结果，本研究进一步分析了 ASCL1 表达水平与BC化疗药物敏感性的关系，并利用 GDSC 数据库评估了该相关性。对比 ASCL1 高表达组和低表达组，分析了包括多西他赛、紫杉醇、顺铂和阿霉素在内的常用化疗药物的半数抑制浓度（IC50）。结果显示，ASCL1 高表达组的 IC50 值均显著高于低表达组（图 4H-K），表明 ASCL1 高表达可能降低BC对这些化疗药物的敏感性。这一发现提示 ASCL1 可能对BC化疗疗效产生不利影响。
（七） ASCL1 抑制可抑制BC细胞体外进展
生物信息学分析提示 ASCL1 在BC进展中发挥关键作用，因此本研究进一步进行了实验验证。为了探究 ASCL1 在BC细胞中的功能，构建了稳定过表达 ASCL1 的BC细胞系（OE-ASCL1-MCF-7 和 OE-ASCL1-MDA-MB-231）。qRT-PCR 和 Western blot 分析结果均显示，ASCL1 过表达细胞中 ASCL1 的 mRNA 和蛋白水平显著升高（图 5A-B）。
在功能实验方面，CCK-8 和克隆形成实验表明，ASCL1 过表达可显著促进BC细胞增殖（图 5C-D）。伤口愈合实验显示，ASCL1 过表达可显著增强细胞的迁移能力（图 5E-H），Transwell 侵袭实验进一步证实 ASCL1 显著促进细胞的迁移和侵袭能力（图 5I-L）。这些结果共同表明，ASCL1 在BC细胞中发挥促恶性行为的作用，增强其增殖、迁移和侵袭能力。
为了评估 ASCL1 抑制在BC细胞进展中的作用，本研究使用质粒转染BC细胞，以敲低 ASCL1 表达。qRT-PCR 和 Western blot 分析均证实 ASCL1 在敲低组中的表达水平显著下降（图 6A-B）。ASCL1 抑制可显著降低细胞增殖能力（图 6C）。伤口愈合实验和 Transwell 侵袭实验表明，ASCL1 抑制显著降低了细胞的迁移和侵袭能力（图 6D-K）。
鉴于上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）在促进细胞迁移中的关键作用，本研究进一步分析了 ASCL1 与 EMT 之间的关系。Western blot 结果证实，ASCL1 抑制可抑制 EMT 过程，从而减少BC细胞的迁移和侵袭能力（图 6L）。
更重要的是，ASCL1 抑制可增强BC细胞对紫杉醇的敏感性，提示其可降低BC细胞的耐药性（图 6M-N）。进一步分析显示，ASCL1 敲低可下调 ATP 结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporter, ABCG2），该蛋白被认为与BC的耐药性相关，也被称为BC耐药蛋白（图 6O）。ABCG2 表达降低进一步证实，ASCL1 抑制可提高BC细胞对紫杉醇的敏感性。这些结果共同表明，靶向 ASCL1 可有效抑制BC的体外进展。
（八） ASCL1 抑制通过激活铁死亡增强BC对紫杉醇的敏感性
为了进一步探讨 ASCL1 抑制对BC细胞的影响，本研究从 TCGA BC队列中提取了 ASCL1 高表达组与低表达组之间的差异表达基因，并进行了基因集富集分析。分析结果显示，这些差异基因在铁死亡通路中显著富集，提示 ASCL1 可能与铁死亡相关（图 7A）。
为了验证这一关联，本研究检测了丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）等铁死亡标志物的水平。结果发现，ASCL1 抑制可导致 MDA 和 ROS 水平升高，同时 GSH 水平下降，GSH/GSSG 比率降低，这一现象在 sh-ASCL1-MCF-7 和 sh-ASCL1-MDA-MB-231 细胞中均得到验证（图 7B-F）。
透射电子显微镜进一步提供了证据，与 sh-NC 组相比，sh-ASCL1 组的细胞表现出典型的铁死亡特征，包括线粒体缩小、体积减少、嵴结构丧失及膜密度增加（图 7G, H）。这些结果共同证实，ASCL1 抑制可诱导BC细胞发生铁死亡。
考虑到 ASCL1 抑制可增强BC细胞对紫杉醇的敏感性，本研究进一步探讨了铁死亡是否参与这一过程。CCK-8 结果表明，在紫杉醇单独处理下，sh-ASCL1 BC细胞的存活率显著低于 sh-NC 细胞。然而，当联合铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 和紫杉醇处理时，两组细胞的存活率差异消失。这一结果表明 ASCL1 对紫杉醇敏感性的影响可能与铁死亡有关。此外，联合铁死亡激活剂 Erastin 和紫杉醇处理可显著降低细胞存活率，且 sh-ASCL1 组的下降幅度更明显（图 7I-J）。这些结果提示，ASCL1 抑制可能通过激活铁死亡增强BC细胞对紫杉醇的敏感性。
（九） ASCL1 抑制通过 CREB1/GPX4 轴激活BC细胞铁死亡
为了进一步探究 ASCL1 调控铁死亡的分子机制，本研究在 TCGA-BRCA 队列的 ASCL1 高表达组与低表达组之间筛选出了 474 个差异表达基因，其中 248 个基因上调，226 个基因下调，并通过 KEGG 通路分析（|log2FC| > 1，调整后 P < 0.05）发现 ASCL1 可能与 cAMP 信号通路相关（图 8A）。通过生物信息学分析，最终确定了 cAMP 响应元件结合蛋白 1（cAMP-responsive element-binding protein 1, CREB1）为 ASCL1 调控铁死亡的靶基因（补充图 1）。CREB1 是一种磷酸化依赖性转录因子，可调控谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）的转录，而 GPX4 是铁死亡的关键抑制因子。因此，ASCL1 可能通过 CREB1/GPX4 轴调控BC细胞的铁死亡。
本研究首先进行蛋白分子对接实验，分析 ASCL1 与 CREB1 的结合情况。结果显示，两者之间存在稳定的氢键连接，提示 ASCL1 可能调控 CREB1（图 8B）。免疫荧光实验进一步证实，ASCL1 和 CREB1 在BC细胞中共定位，而 ASCL1 抑制可显著降低这一共定位信号（图 8C）。Co-IP 结果表明 ASCL1 可与 CREB1 结合，且 ASCL1 抑制可促进该复合物的解离（图 8D）。
Western blot 进一步证实，ASCL1 抑制可降低BC细胞中 CREB1 在 Ser133 位点的磷酸化水平（图 8E）。由于 CREB1 作为磷酸化依赖性转录因子，其活性显著依赖于磷酸化状态，CREB1 的磷酸化降低会导致 GPX4 表达下降，从而诱导铁死亡（图 8G）。综上，本研究证实 ASCL1 可通过 CREB1/GPX4 轴调控BC细胞的铁死亡。
（十） ASCL1 抑制在 体内 可增强BC对紫杉醇的敏感性
细胞实验已证实 ASCL1 抑制可增强BC细胞对紫杉醇的敏感性。为进一步验证这一作用，本研究在 BALB/c 裸鼠中进行了体内实验（图 9A）。结果表明，sh-ASCL1 组的肿瘤体积和重量均显著低于 sh-NC 组（图 9B-D）。此外，Western blot 分析进一步证实，ASCL1 敲低可在体内抑制 CREB1/GPX4 轴（图 9E）。这些结果与体外研究一致，表明靶向 ASCL1 通过诱导铁死亡可抑制BC进展，并增强BC对紫杉醇的敏感性。
