华蟾素注射液（HCSI）作为源于中华大蟾蜍皮肤提取物的中药制剂，在骨肉瘤治疗中展现出潜在价值。发表于《Chinese Medicine》（2025年，影响因子5.7）的研究通过整合代谢组学、网络药理学与生物信息学方法，系统揭示了HCSI抗骨肉瘤的分子机制，为骨肉瘤的靶向治疗及中药抗肿瘤研究提供了新视角。
Highlights
l核心靶点鉴定：筛选出HMGCR作为HCSI抗骨肉瘤的关键靶点，其通过BCYRN1-miR-27a-3p-HMGCR轴调控脂质代谢。
l作用机制：HCSI通过下调HMGCR表达，降低细胞内胆固醇水平，诱导骨肉瘤细胞凋亡，且涉及免疫微环境调节。
l临床潜力：HMGCR在骨肉瘤组织中高表达，与不良预后相关，为骨肉瘤的诊断和治疗提供了潜在靶点。
背景介绍
骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，主要发生于青少年和老年人，目前治疗以新辅助化疗、手术切除和辅助化疗为主，但肺转移患者5年生存率仅20-30%。代谢重编程是癌症的重要特征，其中脂质代谢异常在肿瘤进展中起关键作用。HCSI已被批准用于临床肿瘤治疗，其活性成分包括华蟾毒精、蟾毒灵等，前期研究显示其可通过调控代谢抑制肝癌等肿瘤进展，但抗骨肉瘤的具体机制尚未明确。本研究整合多组学技术，旨在挖掘HCSI抗骨肉瘤的核心靶点及通路。
研究的图形摘要
主要研究结果
1.代谢组学揭示脂质代谢异常
采用非靶向代谢组学分析HCSI处理后的SAOS2细胞，正离子模式下对照组、HCSI组和QC组的PCA模型显示QC样本密集分布，数据质量良好（图1A）；负离子模式下的PCA模型同样显示各组分离趋势及QC样本稳定性（图1B）。正离子模式下对照组与HCSI处理组的OPLS-DA得分散点图（图1C）和负离子模式下的OPLS-DA得分散点图（图1D）显示，两者R2Y和Q2值均较高（正离子模式R2Y=0.996、Q2=0.929；负离子模式R2Y=0.995、Q2=0.963），提示HCSI处理导致显著代谢差异。正负离子模式下差异代谢物的层次聚类热图共鉴定出289个差异代谢物（图1E）；差异代谢物的富集代谢通路气泡图显示脂肪酸降解、脂肪细胞脂解调控等脂质代谢通路显著受影响，关键代谢物包括鞘氨醇、棕榈酸等（图1F）。
图1 HCSI可能通过调控脂质代谢影响骨肉瘤细胞进展
2.网络药理学筛选关键靶点
从HERB等数据库获取HCSI的27个活性成分，GSE16088和GSE16091数据集的标准化箱线图显示数据标准化效果良好（图2A）；44个差异表达基因及交集靶点的热图（图2B）和差异基因的火山图（图2C，红色代表上调基因，绿色代表下调基因）直观呈现基因表达变化。通过Venn分析获得HCSI、脂质代谢与骨肉瘤的44个交集基因（图2D）；“药物-活性成分-靶点”网络图中，圆形节点代表活性成分，菱形节点代表靶点，V形节点代表药物，展示了多成分-多靶点的作用模式（图2E）。
图2 基于脂质代谢的HCS抗骨肉瘤靶点鉴定
3.ceRNA网络构建与核心靶点筛选
分析GEO数据集获得差异lncRNA和miRNA，GSE225588数据集中差异lncRNA的火山图显示519个上调、474个下调（图3A）；993个差异lncRNA的热图（图3B）展示其表达模式。GSE65071数据集中差异miRNA的火山图显示13个上调、136个下调（图3C）；149个差异miRNA的热图（图3D）呈现其表达特征。ceRNA与网络药理学交集mRNA的Venn图获得8个基因（图3E）；“lncRNAs-miRNAs-mRNAs”ceRNA网络图中，三角形节点代表lncRNAs，圆形节点代表miRNAs，V形节点代表mRNAs，节点大小与RNA的度值相关（图3F）。
图3 骨肉瘤中lncRNA和miRNA的差异表达
4.机器学习算法筛选核心靶点
LASSO逻辑回归算法的系数和正则化图（图4A）、随机森林算法的准确率曲线（筛选出6个相关特征，图4B）及SVM-RFE算法的五折交叉验证准确率和误差率曲线（最大准确率=0.97，最小RMSE=0.0299，图4C）共同筛选核心基因。3种机器学习算法交集靶点的Venn图获得HMGCR、BACE1和HIF1A（图4D）；这3个靶点在GSE16088和GSE16091数据集中的表达箱线图显示均在骨肉瘤组织中高表达（图4E-G）。
图4 通过机器学习鉴定HCS的核心靶点
5.调控轴鉴定与分子对接验证
HCSI处理后SAOS2和U2OS细胞中HMGCR、HIF-1A和BACE1的qRT-PCR分析结果显示仅HMGCR表达显著下调（图5A）；基于TARGETOS数据集的HMGCRmRNA表达的Kaplan-Meier总生存曲线显示高表达患者生存率更低（p=0.0287，图5B）。lncRNAs-miRNAs-HMGCR网络（图5C）、HCSI处理后SAOS2和U2OS细胞中miR-27a-3p和miR-206的qRT-PCR分析（图5D）及10个lncRNA的表达变化（BCYRN1表达显著降低，图5E）共同确定BCYRN1-miR-27a-3p-HMGCR轴。10种化合物与HMGCR的分子对接结果可视化中，绿色部分代表HMGCR蛋白，红色部分代表化合物，黄色虚线为氢键相互作用，蓝色部分为参与氢键的氨基酸残基，结合能均低于-7kJ・mol⁻¹（图7）。
图5 lncRNA-miRNA-mRNA轴的构建
图7 分子对接验证
6.免疫浸润与功能验证
消除GTEX和TCGA数据库间批次效应的结果（图6A）；484个样本中22种免疫细胞浸润的堆叠柱状图（图6B）展示免疫细胞分布。正常组与骨肉瘤组22种免疫细胞浸润水平的箱线图显示naiveB细胞、M2巨噬细胞等在骨肉瘤中浸润增加（图6C）。HMGCR表达与22种免疫细胞的相关性棒棒糖图（图6D）及与Tregs、CD8⁺T细胞的相关性散点图（P<0.05，图6E-F）显示其负相关关系。体外实验中，CCK-8法检测不同浓度HCSI对U2OS、SAOS2、MG-63和143B细胞活力的影响，筛选出合适干预浓度（图8A）；HCSI诱导U2OS和SAOS2细胞凋亡的流式细胞结果（图8B-C）、伤口愈合实验检测其对细胞迁移的抑制作用（图8D-E）及Westernblot检测Bcl-2和Bax表达（HCSI降低Bcl-2、升高Bax，图8F）均验证其抗肿瘤作用。
图6 免疫细胞浸润分析
图8 HCSI在体外抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移
7.脂质代谢调控机制验证
BODIPY493/503染色观察U2OS和SAOS2细胞内中性脂质含量，显示HCSI处理后脂质滴增加（图9A-B）。qRT-PCR检测SCD1、SREBF1等脂质代谢相关基因的mRNA表达，显示HCSI显著下调其表达（图9C）；Westernblot检测SCD1、SREBF1和HMGCR的蛋白水平，均被HCSI抑制（图9D-E）。HMGCR与SCD1、HMGCS1mRNA表达的Spearman相关性分析显示显著关联（r=0.54、0.53，p<0.01，图9F）；HCSI处理后细胞内胆固醇水平测定显示含量降低（图9G）；DCFH-DA染色观察细胞内ROS水平，显示HCSI处理后ROS增加（图9H-I）。
图9 HCSI调控骨肉瘤细胞的脂质代谢
8.联合用药机制验证
HCSI和辛伐他汀处理后细胞胆固醇水平测定显示联合处理降低更显著（图10A）；qRT-PCR检测mRNA、miRNA和lncRNA表达变化（图10B-D）及Westernblot检测蛋白表达（图10E-F）呈现联合用药效应。流式细胞检测细胞凋亡率显示联合处理凋亡增加（图10G-H）；Western blot 检测Bcl-2和Bax表达显示联合处理促进凋亡（图10I-J）。
图10 HCSI 通过调控HMGCR抑制骨肉瘤细胞进展
研究小结
本研究首次明确HMGCR是HCSI抗骨肉瘤的关键靶点，HCSI通过调控BCYRN1-miR-27a-3p-HMGCR轴，下调HMGCR表达以减少胆固醇合成，诱导骨肉瘤细胞凋亡，且涉及免疫微环境调节。HMGCR在骨肉瘤中高表达且与不良预后相关，为骨肉瘤的诊断和治疗提供了新靶点。
方法学亮点：整合代谢组学、网络药理学与生物信息学，结合机器学习算法和多数据库验证，系统解析了HCSI通过脂质代谢调控抗骨肉瘤的分子机制，为中药复方的机制研究提供了多组学整合的研究范式。