这篇文章是2025年6月发表在《Experimental Hematology & Oncology》（IF:13.5）期刊上的文章《Multi-omics analyses of the heterogenous immune microenvironment in triple-negative breast cancer implicate UQCRFS1 potentiates tumor progression》。
背景介绍
三阴性乳腺癌（TNBC）因其缺乏治疗靶点、侵袭性强和预后差而成为乳腺癌中最棘手的亚型。肿瘤免疫微环境（TME）在肿瘤进展和免疫治疗应答中起着决定性作用，但其在TNBC中的异质性（即细胞组成和状态的多样性）尚未被完全阐明。该研究旨在利用多组学分析（包括单细胞RNA测序、空间转录组、蛋白组学和批量转录组数据）系统解析TNBC的异质性TME，鉴定关键的细胞亚群和分子特征，并构建有效的预后模型，最终通过实验验证关键基因UQCRFS1的促癌功能。
图形摘要
主要研究结果
(一)绘制TNBC单细胞图谱并揭示关键免疫细胞亚群
为解析初治三阴性乳腺癌（TNBC）的异质性免疫微环境，研究收集了九例患者的活检肿瘤组织进行单细胞RNA测序。经过质控筛选后，最终获得92,304个细胞，并将其划分为八大主要细胞类型：B细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、壁细胞、髓系细胞、浆细胞和T细胞。基于患者来源或主要细胞类型的UMAP可视化结果展示于图2A、B；图2C则呈现了九例患者中八种主要细胞类型的比例分布。此外，这些细胞类型通过经典谱系标志物得以鉴定：B细胞（CD79A、CD79B、MS4A1）、内皮细胞（CDH5、PECAM1、VWF、CLDN5）、上皮细胞（EPCAM、CDH1、KRT8、KRT18）、成纤维细胞（DCN、COL1A1、COL1A2）、壁细胞（RGS5、ACTA2、TAGLN）、髓系细胞（CD14、FCN1、C1QC）、浆细胞（JCHAIN、MZB1、IGHG1）及T细胞（CD2、CD3D、TRAC、TRBC2）（图2D-F）。
(二)TNBC髓系细胞特征分析
基于t-SNE算法，髓系细胞被重新划分为六个亚群：巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、耐受性树突状细胞（tDCs）、浆样树突状细胞（pDCs）和经典树突状细胞（cDCs）（图3A），各亚群的标志物如图3B、C所示。我们进一步聚焦巨噬细胞，鉴定出四个亚群：S100A8+巨噬细胞、IL1B+巨噬细胞、FOLR2+巨噬细胞和MKI67+巨噬细胞（图3D）。通过小提琴图展示各亚群标志物的表达水平，验证了分群的准确性（图3E）。CellChat分析显示巨噬细胞各亚群间存在广泛通讯（图3F）。
进一步利用hallmark通路集进行功能通路富集分析，探索各亚群潜在的相关信号通路和生物学功能（图3G）。具体而言，FOLR2+巨噬细胞主要富集于雄激素反应、移植物排斥；IL1B+巨噬细胞富集于凋亡、缺氧、炎症反应等通路；MKI67+巨噬细胞在DNA修复、有丝分裂纺锤体、G2/M检查点等通路显著富集；S100A8+巨噬细胞则主要富集于活性氧通路、氧化磷酸化等。随后通过代谢通路分析发现，FOLR2+和MKI67+巨噬细胞亚群代谢通路活性相对增强，而S100A8+和IL1B+亚群代谢活性较低（图3H）。
转录因子（TF）分析显示：IL1B+巨噬细胞中CREM、PDRM1、REL、IRF8等转录因子显著激活；MKI67+巨噬细胞以RAD21和MYC为主；FOLR2+巨噬细胞中CEBPD和MAFB明显上调；S100A8+巨噬细胞中CEBPBM、YY1、IRF2等显著高表达（图3I）。基于GSE96058和MATABRIC-TNBC队列的生存分析证实，这些巨噬细胞亚群特异性转录因子均是TNBC患者总体生存的不良预后因素（图3J）。综上研究证实，TNBC肿瘤微环境中的髓系细胞（特别是巨噬细胞）在功能通路和转录因子表达方面具有显著异质性，提示大量巨噬细胞亚群与TNBC患者预后不良密切相关。
(三)TNBC中成纤维细胞与B/浆细胞的多样性
现有研究证据表明，原发性或转移性肿瘤中的成纤维细胞具有显著的适应性、可塑性与恢复力，通过参与肿瘤微环境（TME）中多种细胞群体的复杂相互作用，推动肿瘤进展。本研究对成纤维细胞进行重聚类，基于t-SNE算法明确了四个亚群（Fib_C0—C3）（图4A）。热图展示了这些亚群间的差异表达基因（图4B）。CellChat分析显示，与Fib_C2和Fib_C3亚群相比，Fib_C0和Fib_C1亚群具有更活跃的细胞间通讯（图4C）。伪时序分析揭示了从Fib_C2亚群向其他亚群分化的独特轨迹（图4D、E）。
随后，我们鉴定出两个B细胞亚群（初始B细胞与记忆B细胞）及两个浆细胞亚群（JCHAIN+浆细胞与IGG+浆细胞）（图4H），各亚群的标志物表达特征如图4I、J所示。Monocle分析揭示了从B细胞向浆细胞分化的连续过程（图4K）。通路富集分析表明：初始B细胞与记忆B细胞主要富集于自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性、T细胞受体信号通路等免疫调控通路；而JCHAIN+与IGG+浆细胞则显著增强泛素介导的蛋白水解、补体与凝血级联等通路活性（图4L）。
进一步通过转录因子（TF）分析发现：浆细胞亚群中XBP1表达显著上调，而初始B细胞与记忆B细胞亚群中STAT1表达更为活跃（图4M、N），这两类转录因子均是B细胞分化过程中的关键调控因子。综上所述，本研究从分化轨迹、功能通路和转录因子表达三个维度，系统阐释了TNBC肿瘤微环境中成纤维细胞与B/浆细胞的多样性特征。
(四)TNBC中T/NK细胞的异质性特征
T细胞与NK细胞是肿瘤微环境（TME）中的重要组成部分。我们通过t-SNE算法对T/NK细胞进行鉴定与重分类，识别出CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、调节性T细胞（Tregs）、MKI67+ T细胞、NK细胞及NKT细胞等主要群体（图5A），其标志物表达如图5B所示。进一步分析显示，CD4+ T细胞包含三个亚型（IL7R+、CXCL13+和NKG7+ CD4+ T细胞），CD8+ T细胞包含六个亚型（GZMB+、CXCL13+、IL7R+、GZMK+、GNLY+和NR4A2+ CD8+ T细胞），Tregs则分为IL32高表达（IL32high）与低表达（IL32low）两个亚型（图5C、D）。
CellChat分析揭示了这些亚型与上皮细胞间的通讯差异：CXCL13+ CD4+ T细胞、GZMB+与IL7R+ CD8+ T细胞以及IL32high Tregs与上皮细胞表现出更显著的相互作用（图5E）。为进一步评估各T/NK亚型的综合功能，研究对比了其免疫相关基因（共刺激、共抑制及功能标志物）的表达水平（图5F），并发现不同亚型在T细胞耗竭、细胞毒性、效应功能及免疫逃逸特征评分上存在显著差异（图5G）。其中，CXCL13+ CD8+ T细胞在耗竭特征中评分最高；GZMK+ CD8+ T细胞在细胞毒性及效应功能中作用最为突出；而IL32high Tregs则在免疫逃逸过程中发挥关键作用。
通过对比IL32high与IL32low Tregs的功能通路差异，发现IL32high Tregs显著富集于翻译失调调控、PD-L1/PD-1检查点通路及原发性免疫缺陷等免疫失调相关通路（图5H）。基于GSE96058队列的分析进一步证实，TNBC患者中IL32high Tregs特征评分越高，其预后越差（图5I）。综上研究表明，TNBC微环境中的免疫细胞存在高度异质性，其中IL32high Tregs可能通过促进免疫逃逸导致患者不良预后。
(五)TNBC上皮细胞亚群的异质性解析
为明确TNBC上皮细胞的异质性，研究采用"inferCNV"算法区分正常上皮细胞与恶性上皮细胞，并对恶性细胞进行重聚类分析，鉴定出八个亚群（Malignant_C0–C7）（图6A、B）。各亚群的标志物表达特征如图6C所示。通过对比恶性细胞亚群的拷贝数变异（CNV）评分，发现Malignant_C3亚群的CNV评分显著高于其他亚群（图6D）。CellChat分析显示，Malignant_C5亚群在恶性细胞亚群间具有最广泛的相互作用（图6E）。基于GO和hallmark数据库的功能富集分析表明：Malignant_C5亚群参与T细胞活化、细胞间黏附、细胞外基质组织及上皮间质转化（EMT）的调控；Malignant_C2亚群主要富集于干扰素α/γ反应通路；Malignant_C1亚群则在脂肪酸代谢、糖酵解、氧化磷酸化和活性氧通路等代谢调控中发挥潜在作用（图6F、G）。进一步分析恶性细胞亚群的转录因子活性及免疫相关基因（共刺激、共抑制及功能标志物）表达发现：Malignant_C5亚群中CCAAT增强子结合蛋白家族转录因子及多种免疫调控基因表达上调；而与干扰素反应相关的关键转录因子（如STAT1、IRF1）在Malignant_C2亚群中显著激活（图6H、I）。综上研究表明，TNBC恶性上皮细胞各亚群通过不同的功能通路特征，可能对肿瘤微环境的演进产生重要影响。
(六)基于TNBC恶性上皮细胞标志物构建与验证MCI评分体系
(七)MCI的临床应用价值
三阴性乳腺癌作为乳腺癌中具有高度侵袭性的亚型，其有效治疗手段十分有限，而免疫检查点阻断（ICB）疗法的出现为TNBC治疗带来了巨大潜力。为探究MCI是否与免疫治疗反应预测相关，本研究收集了GSE173839队列的转录组数据（包含接受ICB治疗[德瓦鲁单抗联合奥拉帕利]及紫杉醇治疗的TNBC患者）。通过计算该队列中每位TNBC患者的MCI值，发现对ICB治疗未达到病理完全缓解（nCR）的患者其MCI值显著高于达到病理完全缓解（pCR）的患者（图8G）。随后以MCI中位值为界将患者分为MCI高、低表达亚组，结果显示MCI高亚组中nCR患者比例显著高于低亚组（图8H）。ROC曲线分析显示曲线下面积（AUC）达0.733，证实MCI在免疫治疗反应预测中具有良好准确性（图8I）。
上述发现在我们包含7例确诊TNBC并接受新辅助ICB治疗及化疗患者的单细胞测序队列中得以验证（图8J）。值得注意的是，其中4例达到pCR状态，其余为nCR状态，UMAP图谱清晰展示了这一分布（图8K）。各主要细胞类型中MCI的分布情况如图8L所示，单细胞数据进一步揭示免疫治疗nCR组患者的累积MCI值显著高于pCR组，与前述结论高度一致（图8M）。具体而言，通过对比各主要细胞类型中不同治疗反应组别的MCI值，发现除正常上皮细胞外，nCR组在大多数细胞类型（包括恶性细胞）中均呈现显著升高的MCI值（图8N）。这些发现共同表明，MCI可作为预测TNBC患者免疫治疗不良反应的有效指标。
(八)UQCRFS1的功能验证
在MCI包含的恶性相关基因中，铁硫黎簇蛋白（UQCRFS1）在TNBC中的具体机制尚不明确。为此，我们深入探讨了UQCRFS1在TNBC中的表达特征及临床意义。首先，通过分析GSE76250数据集中配对癌组织与癌旁样本发现，UQCRFS1在TNBC组织中表达明显增强（图9A）。随后采用qRT-PCR技术验证细胞系中的mRNA表达水平，发现相较于乳腺上皮细胞MCF-10A，TNBC细胞系中UQCRFS1的mRNA表达显著升高（图9B），这与前期生物信息学分析结果一致。基于FUSCC蛋白质组数据分析显示，TNBC患者组织中UQCRFS1的蛋白表达水平同样呈现上调趋势（图9C）。Western blot实验进一步在蛋白层面证实，TNBC细胞系中UQCRFS1表达显著增强（图9D）。通过分析包含TNBC患者的空间转录组（ST）数据集，发现UQCRFS1主要富集于肿瘤区域，而在正常导管区域表达较弱（图9E、F）。
总结
本研究通过多组学整合分析，系统描绘了三阴性乳腺癌高度异质的肿瘤免疫微环境图谱，鉴定出一个关键的免疫抑制性Treg亚群，构建了一个基于恶性上皮细胞特征的预后模型，并首次深入验证了线粒体基因UQCRFS1在TNBC中的促癌功能及其与免疫治疗抵抗的关联。