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几丁质(chitin)、又名甲壳质、甲壳素，常见于甲壳类动物、昆虫外壳以及真菌细胞壁，是自然界产量仅次于纤维素的天然多糖，年产量约为1011吨(1)。几丁质及其脱乙酰化产物壳聚糖(chitosan)因其具有的多种生物活性，良好的生物可降解性及生物相容性，已被作为一种优秀的天然材料应用于诸多领域。
然而，几丁质及壳聚糖较差的水溶性一定程度上限制了其更广泛的应用，其降解得到的低分子量寡糖产物-几丁类寡糖（chitooligosaccharide）水溶性良好、天然无毒、环境友好，且在抗炎、抗菌、抗癌、免疫调节、细胞修复、植物免疫诱导等多方面展现出更好的生物活性(1-4)，在医药、食品、化妆品以及农业等诸多行业展现出巨大的应用潜力(5-7)，相关产业近些年成长迅速。
随着几丁类寡糖研究及寡糖结构分析技术的不断发展，其结构的复杂性逐渐被揭示，特定结构与生物活性的关系日渐明确，现有几丁类寡糖产品存在生产工艺落后、构效关系不明确等问题，亟待升级。具有明确结构特征、更高生物活性的寡糖将成为新一代产品的开发方向。本文就几丁类寡糖的分类定义、生产工艺、构效关系等几个方面介绍近年来的研究进展。
分类定义
Chitooligosaccharides在中文中通常被称为壳寡糖，几丁寡糖或低聚壳聚糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖及其脱乙酰化产物氨基葡萄糖组成，是聚合度小于20，平均分子量小于3.9 kDa的低聚糖链(5)。如同其制备原料几丁质与壳聚糖，chitooligosaccharides也常被分为两类：脱乙酰度（DD）大于70%的通常称为壳寡糖(chitosan oligosaccharides)；另一类脱乙酰度较低（DD<50%）的称为几丁寡糖（chitin oligosaccharides）。这种分类方法很大程度上源于寡糖制备工艺方法局限性。
传统工艺中，因为几丁质不溶于水、碱和有机溶液，只溶于部分浓酸，因此甲壳类原料首先通过加入强碱脱乙酰生产可溶于稀酸的脱乙酰度大于70%的壳聚糖，从而实现工业上的大规模制备。以此壳聚糖为原料降解制备壳寡糖的脱乙酰度也在这个范围。随着chitooligosaccharide研究的进一步深入，这种分类及中文命名方式出现了一些问题，比如对脱乙酰度在50%-70%之间的寡糖缺乏定义，而这类被称为hetero-chitooligosaccharides的寡糖由于其更优的生物活性及物理化学性质，已成为壳寡糖研究领域及相关产业的最新热点(1, 4)。
可以看出，chitooligosaccharide类寡糖的分类及中文命名存在很多定义不清以及命名混淆的状况。在本文中为便于叙述，我们定义脱乙酰度大于70%的为壳寡糖(chitosan oligosaccharide, COS)；脱乙酰度低于50%的为几丁寡糖（chitin oligosaccharide, CTOS）；脱乙酰度在50%-70%之间的为HT-壳寡糖（hetero-chitooligosaccharide, HT-COS）；而这些寡糖统称为几丁类寡糖（chitooligosaccharide）。尽管脱乙酰度是几丁类寡糖分类的重要依据，寡糖的聚合度（DP）、分子量（MW）、分子量分布（PD）以及乙酰化分布模式（PA）等结构特征均直接影响几丁类寡糖的生物活性，并可以依照这些特征进行更细致的分类(8)。
生产工艺技术研发
目前，几丁类寡糖主要通过物理、化学方法或酶法降解壳聚糖或几丁质制备生产。几丁类寡糖的物理降解研究相对较少，方法主要包括超声降解(9)及γ-辐照(10)，工业制备主要通过化学法及酶法。
传统化学法制备工艺主要使用强酸降解，包括酸解、中和、分离、干燥等步骤(11)。除了使用强酸降解，双氧水也可以用于寡糖制备(12)。化学降解方法步骤较复杂，且较难控制寡糖产物的聚合度、脱乙酰度等结构特征，其寡糖产物的聚合度较低，而生物活性更优的高聚合度寡糖产物较少(11)。此外，还存在副产物较多、环境不友好等问题。相较而言，酶法制备是更有效、应用更广泛的方法。酶法制备可使用特异性的几丁质酶和壳聚糖酶，也可以使用非特异性的糖苷酶以及蛋白酶。酶法降解具有高效、反应温和、产物结构可控、环境友好无污染等优点，具适用于几丁类寡糖生产制备。
图1.中科荣信寡糖产品（酶法制备）
构效关系研究
近期研究表明，脱乙酰度50%及68%的HT-壳寡糖生物活性比传统壳寡糖更强(13)。目前研究认为，HT-壳寡糖既有足够数量的乙酰基团参与表面受体结合，其所具有的正电荷也可以发挥壳寡糖的活性作用，同时在较高聚合度（DP>8）的情况下仍具有较好的水溶性，因此已成为几丁类寡糖最新的研究方向。此外，HT-壳寡糖的脱乙酰化程度更接近于自然界中真菌细胞壁几丁质/壳聚糖的脱乙酰度范围，这一特征也可能是其优良免疫活性的结构基础，因为真菌细胞壁组分正是免疫系统的识别信号。然而，这种脱乙酰度范围也带来HT-壳寡糖结构上的复杂性，给HT-壳寡糖的分离纯化与结构鉴定带来挑战。
以脱乙酰度50%的杂壳四糖为例，在聚合度和脱乙酰度相同的情况下，其单体均由2个氨基葡萄糖和2个N-乙酰氨基葡萄糖组成，但从糖链还原端到非还原端不同的单糖排列顺序可以产生6种不同结构的寡糖单体。这一新的发现极大增加了几丁类寡糖的结构复杂性 （图2）。
图2.几丁类寡糖结构特征示意图
近期研究通过使用特定的几丁质酶、壳聚糖酶及脱乙酰酶，结合分离纯化方法的改进，以及质谱、NMR等结构鉴定技术的发展，制备了种类多样、结构确定的HT-壳寡糖单体(14, 15)，为HT-壳寡糖构效关系的深入研究及应用奠定了基础。令人惊讶的是，体外细胞活性实验表明，仅仅一个乙酰化位点不同，这些寡糖同分异构体的生物活性相差很大(16)。我们近期也开发了基于特定酶的几丁类寡糖绿色清洁化生产工艺，制备了聚合度、脱乙酰度、乙酰化分布模式可控，结构明确的HT-壳寡糖及几丁寡糖。室内及田间试验表明，这些寡糖展现出良好的生物活性，在一些功能方面是传统高脱乙酰度壳寡糖产品的数倍。
讨论
综上所述，几丁类寡糖在健康产业、农业等方面已显现出巨大的应用价值，以聚合度为主要特征的第一代高脱乙酰度（DD>70%）壳寡糖产品在多个领域被成功开发。然而，目前几丁类寡糖产品类型单一，所开发的农药、饲料添加剂及功能食品产品均属于本文所述壳寡糖的范畴。此外，目前产品结构表征相对不足，一般仅对聚合度和脱乙酰度有较为笼统的限定，造成相关产品质量水平良莠不齐。
越来越多的研究表明，寡糖的生物活性受聚合度、脱乙酰度、乙酰化分布模式等结构特征的影响而产生巨大差别。因此，对于壳寡糖类产品需要更科学系统的结构表征及分类规范。HT-壳寡糖因其结构与天然免疫诱导结构更近似所带来高活性特点，目前随着绿色清洁化可控酶解制备工艺的成熟，第二代聚合度可控，脱乙酰度范围更接近自然状况的壳寡糖类产品即将面世。而随着定点脱乙酰化技术的不断成熟及制备、检测技术的完善，未来也将出现三大结构特征明确可控（即聚合度、脱乙酰度、乙酰化位点）的第三代壳寡糖类产品。这些寡糖产品对制备技术提出了更高更科学的要求，但也将具有更广阔的应用前景。
参考文献
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