众所周知，免疫系统是机体不可缺少的防御系统，它可保护机体抗御病原体，免受有害物及病毒、细菌等致病因子的侵害。同时清除损伤和衰老细胞，保持自身稳定，与神经内分泌系统共同维护，相互调节机体生理平衡。
高等动物的免疫系统可分为天生免疫系统与获得性免疫系统。中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）和巨噬细胞一起作为专职性吞噬细胞在高等动物的天生免疫中发挥了重要作用。
PMN 是人体和哺乳动物抵御外来微生物入侵的第一道防线，能够快速激活并迁移到病灶部位，通过释放炎症介质和吞噬作用消灭感染的病原微生物，是非特异性免疫和体液免疫的主要效应细胞。但是中性粒细胞的过度激活及其凋亡障碍使其同时具备了造成机体组织损伤的功能，严重时可导致失控性炎性反应，如全身炎症综合症 (Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，代偿性抗炎反应综合症(compensate anti-inflammation response syndrome, CARS)，甚至造成多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)等，因而中性粒细胞的功能必须被严格调节，以使中性粒细胞既可以有效地清除病原体，同时又不会造成病变部位的进一步损伤。
很多数据文献表明，壳寡糖可以增强免疫，减轻体内炎症，可以明确其聚合度为2-10的寡糖，但其中不同聚合度的壳寡糖是否都有这样的功效呢，哪种单一聚合度的壳寡糖功效更显著呢？
试验通过能够明确聚合度的壳三糖、壳四糖、壳五糖、壳六糖对静息的或是激活的中性粒细胞的作用，判断在增强免疫、减轻炎症上哪种单一聚合度寡糖起效更显著。
试验说明
采用密度梯度离心法从肝素抗凝无菌兔血中分离中性粒细胞。
肝素抗凝的新西兰兔外周血用 pH7.4 的磷酸盐缓冲液PBS(100 mmol/L)1:1 稀释，然后等体积加到 6% 的右旋糖酐上，静置 30 分钟，取上层清液，500g, 离心 10min，所得沉淀用 NH4Cl 溶液破碎红细胞后，500g, 离心 10min，所得沉淀用 PBS重悬，加到密度为 1.087 的 percoll 分离液上层，以同样的离心条件得到的细胞沉淀即为中性粒细胞，用 Giemsa 染色液染色确定细胞纯度大于 90%，台盼蓝染色确定活细胞百分率>95%。
1. 对中性粒细胞活力的影响
采用 MTT 法检测细胞活力，新鲜分离的中性粒细胞分为以下处理组（1）空白对照， （2）单一聚合度壳寡糖处理25μg/mL，(3) 单一聚合度壳寡糖处理50μg/mL, (4) 单一聚合度壳寡糖处理 75μg/mL, (5) 单一聚合度壳寡糖处理 100μg/mL，37° C 孵育 20h, 然后加入 10μl 浓度为 5mg/ml的 MTT 继续孵育 4h，将 96 孔板离心后倒掉上清，每孔加入 100μlDMSO，缓摇溶解 10min 后，570nm 检测吸光值，参考波长 630nm。
MTT 的配制 ：MTT 0.5g，溶于 pH 7.4 的 PBS 缓冲液中，0.22μm 微孔滤膜过滤，避光存放于 4° C。
中性粒细胞在分离之后 48h，若没有外界刺激，细胞基本全部趋于凋亡。
实验中壳五糖、壳六糖在一定浓度下表现出较好的促进细胞活力的活性。其中壳五糖在 25、75 mg/mL 的浓度下均明显提高了细胞的活力（p<0.01），壳六糖在 50、100mg/mL 的浓度下均明显提高了细胞的活力（p<0.05），75mg/mL 浓度下呈现出极为显著性差异（p<0.01）。
壳五糖、壳六糖具有潜在的增强静息的中性粒细胞活力作用。
2. 对PMA过度激活的中性粒细胞释放髓过氧化物酶（MPO）的影响
MPO-H2O2 可以使TMB氧化成蓝色产物，加入硫酸终止反应后呈黄色，于450nm有最大吸收。TMB的氧化产物在单位时间内的生成量与MPO活性成正比，因而OD450nm反映MPO活性。
以 D-Hank's 液调节兔中性粒细胞密度至 2×105 /ml。90μl 中性粒细胞悬液中加入 10μL细胞松弛素B（浓度 10μg/ml）, 37°C 孵育 30min。离心，弃上清，将中性粒细胞重悬于D-Hank's 液中。
实验分组 ：80μl 中性粒细胞悬液 +10μL 单一壳寡糖溶液（浓度0、25、50、75μg/mL）+ 10μLPMA（10-7 M），37℃孵育 30min。离心，弃上清。细胞重悬于 100μLHank’s液中，37℃孵育 30min。
孵育结束后，收集上清 80μL 加入 96 孔板中，每孔加入 TMB 底物液80μL，37℃孵育15min，加入50μL2mol/L的硫酸终止显色反应，震荡均匀后测定OD450nm。
空白对照组以 Hank's 液代替 100μL 中性粒细胞上清液，细胞总 MPO 活性组用 100μL 中性粒细胞含钙裂解液（100μL 中性粒细胞悬液用 0.06%50μlCTAB 裂解）代替中性粒细胞培养上清液，其余操作与实验组相同。
实验发现壳五糖、壳六糖在浓度25、50μg/mL 时能够显著性抑制过度激活的 PMA释放髓过氧化物酶（p<0.01），壳六糖在浓度 75μg/mL 时也具有抑制作用（p<0.05），具有显著的调节作用。
因此，壳五糖、壳六糖具有更明显的提高机体杀菌能力以及抵抗力的作用。
3. 对PMA过度激活的中性粒细胞产生超氧阴离子的影响
用 PBS 调兔中性粒细胞密度至 2×105 /mL。实验分组 ：80μL 中性粒细胞悬液 +10μL 单一壳寡糖溶液（浓度0、25、50、75、100μg/mL）+ 10μLPMA（10-7 M）。37° C 孵育 30min。离心弃上清，加入 NBT（终浓度0.2%）100μL，37℃继续孵育20min。离心弃上清，以100μLDMSO充分溶解，震荡均匀后测定A570nm。以 100μL/ 孔的 DMSO 作为空白。
实验结果表明，壳五糖在 25、75μg/mL 的浓度下对过度激活的中性粒细胞超氧阴离子（O2- ）产生具有明显的抑制（p<0.05），壳六糖在 50、100 μg/mL 的浓度时对过度激活的中性粒细胞超氧阴离子的产生有显著的抑制（p<0.05）。
结 论
壳寡糖中，单一壳五糖、壳六糖可以更好的促进静息的中性粒细胞活力、NO 释放和吞噬大肠杆菌的能力，抑制 PMA 过度激活的中性粒细胞的呼吸爆发、脱颗粒等一种或多种活性从而发挥免疫增强的作用。
壳五糖、壳六糖具有更明显的提高机体杀菌能力以及抵抗力，在免疫增强，减轻炎症上效果更显著。
在壳寡糖产品的选择上，为了增强免疫、减轻炎症，应选择壳五糖、壳六糖含量高的产品才能保证更好的产品功能活性。
中科荣信依托糖生物工程课题组雄厚的技术力量，有自主知识产权生产功能寡糖的新工艺路线，独有的酸化及定点酶解技术，解决了糖链原位分离与聚合度及结构序列可控的绿色规模化生产技术难题，拥有19项专利（包括加拿大、澳大利亚、德国专利技术），能够实现批次化生产壳寡糖产品的精准聚合度，乙酰化位点和脱乙酰度的把控。生产的2.0版壳寡糖-荣创H系列（抗炎促免）、荣创J系列（抗菌增效）、荣创Z系列（疫苗佐剂）、荣创C系列（肠道健康）、荣创G系列（肝脏养护），产品结构明确，生物活性高，符合美国FDA产品质量标准，成为饲料添加剂和动保领域众多客户的选择。
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