临床上，获得性耐药是激酶小分子抑制剂治疗癌症面临的主要挑战。激酶ATP结合口袋中的门卫突变是导致获得性耐药最常见的突变。迄今为止，FDA已经批准了7个以门卫突变为靶点的新一代激酶抑制剂。即便如此，临床需求仍未得到满足。
最近，来自广州暨南大学药学院的陆小云教授等人在JMC杂志上发表综述文章，系统地总结了激酶家族中的门卫突变类型、获得性耐药的结构基础以及新开发的靶向门卫突变的小分子抑制剂，并强调了靶向门卫突变的激酶药物发现的机遇和挑战。
引言
蛋白激酶是一类通过将磷酸基团从ATP转移到底物的酪氨酸、苏氨酸或丝氨酸残基来磷酸化蛋白质的酶家族。这种磷酸化激活下游信号通路，控制细胞的存活、生长、分化和迁移。异常的激酶信号与多种疾病的发生发展有关，如癌症、神经紊乱、炎症、代谢等。目前已发现超过518个激酶，它们已成为主要的药物靶点。截至2022年5月，美国FDA)已批准了73个小分子激酶抑制剂(SMKI)药物。
前言
尽管SMKI治疗患者的临床结果有所改善，但由"靶向"突变驱动的耐药性已成为一大挑战。激酶的" on-target "突变通常发生在ATP结合口袋，如位于"溶剂前沿（solvent front）"的氨基酸,控制抑制剂进入疏水口袋"back cleft"的"门卫（gatekeeper)"氨基酸，以及位于ATP结合口袋活化loop的xDFG突变等。其中，门卫突变是最常发生的诱导激酶药物获得性耐药的突变。迄今为止，FDA批准的用于克服激酶门卫突变导致的临床耐药的激酶药物有7个。
它们分别是正构ATP竞争性抑制剂ponatinib（靶向ABL 突变体T315I）；ceritinib, alectinib brigatinib, 和 lorlatinib (靶向ALK突变体L1196M) ；osimertinib（EGFR T790M)；变构抑制剂asciminib ( Bcr-Abl T315I)，这些抑制剂在临床上显示出良好的效果 。
随着SMKI在临床上越来越多的被发现和使用，门卫突变引起的耐药不可避免的发生。设计能够克服门控突变的新一代SMKI成为药物研发的新挑战和临床需求。在此，我们总结了激酶门控突变的类型，解释了突变如何导致耐药，并讨论了新开发的克服门卫突变的激酶药物。
门卫氨基酸
激酶的门卫氨基酸是连接C端和N端裂片的铰链区的第一个残基(图1A )，通过改变ATP结合口袋的大小和形状来控制抑制剂进入back cleft 或者back pocket。一个大体积的门卫氨基酸可以阻碍抑制剂进入back pocket，而一个小的门卫氨基酸导致back pocket漏出较大的空腔，抑制剂很容易的进入。
一些激酶抑制剂（如II型抑制剂）通常延伸到背部间隙以增加其效力和选择性，这可归因于他们与门卫氨基酸有良好的相互作用以增强结合亲和力，例如伊马替尼与Abl的门卫氨基酸形成氢键，entrectinib与TRKA的门卫氨基酸存在π-π堆积相互作用。
图1. 门卫氨基酸的位置以及特定药物的相互作用
不同激酶的门卫氨基酸类型不同，包括极性氨基酸(例如,苏氨酸和丝氨酸)和非极性残基(如亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等，如图2)。总体而言，近77 %的激酶具有较大的疏水性门为氨基酸，包括甲硫氨酸(38%)、亮氨酸(17%)和苯丙氨酸(14%)。苏氨酸是一种经常作为门卫的极性残基，约占整个激酶家族的20 %。
门卫残基的类型也具有家族特异性。蛋氨酸和亮氨酸在STE、CK1、AGC和CAMK家族中最常见，而CMGC家族中主要的门卫氨基酸是苯丙氨酸。对于大多数被开发的酪氨酸激酶家族，门卫残基通常包括苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸。
图2. 激酶家族门卫氨基酸类型分布和统计
门卫突变的耐药结构机制
门卫突变是导致耐药最常见的获得性"on-target"突变。在常见的五种门卫突变类型中，苯丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸和缬氨酸与耐药相关(表1 )。苯丙氨酸通常突变为亮氨酸，如FLT3 F691L、TRKA F589L、TRKB F633L和TRKC F617L。亮氨酸突变为甲硫氨酸，例如ALK L1196M和ROS1 L2026M。
苏氨酸突变为异亮氨酸，如ABL T315I , PDGFR T674I和KIT T670I或甲硫氨酸，如EGFR T790M和SRC T338M。缬氨酸的突变形式多样，包括甲硫氨酸，例如RET V804M。苯丙氨酸，例如FGFR2 V564F、和亮氨酸，例如FGFR4 V550L，具有门控甲硫氨酸的激酶，如SYK、JAKs、MAP2K1、ROCK1、ROCK2等，目前尚未报道过门控突变。这些突变会增加空间碰撞或者提高ATP结合能， 从而导致抑制剂效能下降。
表1. 代表性激酶门卫突变
苯丙氨酸->亮氨酸突变
苯丙氨酸突变为亮氨酸，如FLT3 F691L、TRKA F589L、TRKB F633L和TRKC F617L，通常会导致相互作用的丧失，导致SMKI的结合亲和力下降(图3A )。苯丙氨酸具有芳香环与SMKIs形成π - π堆积相互作用。如图3B所示，对结构激酶数据库( KLIFS )中可用的激酶晶体结构进行统计发现，门卫苯丙氨酸的两个二面角主要集中在χ1 = 175°和χ2 = 95°。在这种构象下，苯丙氨酸很容易与抑制剂形成π-π相互作用。突变为亮氨酸后，这种堆叠作用消失，抑制剂亲和力下降。
如entrectinib与TRKA的X -射线晶体结构所示，氨基吲唑基团与门卫Phe589形成π-π相互作用。然而，突变的Leu589减弱了π-π相互作用，导致吲唑环和亮氨酸的Cδ原子之间的空间位阻(图3C )。类似地，quizartinib与FLT3的X -射线结构揭示了苯并[d]咪唑基[2,1-b]噻唑骨架与Glu692形成氢键，中间的苯环与Phe691和Phe830形成π-π相互作用。同时，将Phe691突变为Leu691 ( F691L )，消除了π-π相互作用，并与奎扎替尼的中间苯环产生空间位阻冲突。
图3. 苯丙氨酸突变为亮氨酸的门卫突变
苏氨酸->异亮氨酸突变
在诸如激酶PDGFR T674I、KIT T670I、EGFR T790M、SRC T338M和BTK T474I/M中已经报道了门卫苏氨酸突变为异亮氨酸和甲硫氨酸(图4 )。由于异亮氨酸或甲硫氨酸体积较大，没有含羟基的氢键受体，突变通常会引起空间位阻冲突，并取消与抑制剂的氢键。根据激酶晶体结构的二面角分布，苏氨酸的羟基主要有三种不同的取向，χ1值分别为60°，188°和308°。
其中，羟基朝向铰链区( χ1 = 188°)的构象占绝大多数。伊马替尼获得性耐药是苏氨酸-异亮氨酸门卫突变的经典例子。如伊马替尼与ABL的X射线共晶结构(图4C )所示，伊马替尼的氨基嘧啶与Thr315形成氢键。然而，苏氨酸突变为异亮氨酸则取消了关键的氢键。此外，体积庞大的异亮氨酸还与氨基嘧啶环产生空间位阻冲突，导致伊马替尼的药效明显降低。另一个例子是吉非替尼与野生型EGFR的复合物，苏氨酸的χ1二面角为284°，通过水分子介导与苏氨酸形成氢键。在生理条件下，EGFR T790M的门卫突变不会引起显著的空间位阻，但会增加ATP结合亲和力，阻碍吉非替尼的结合。在BTK T474M门控突变中也发现ATP的结合亲和力增加。
图4. 苏氨酸突变为异亮氨酸的例子
缬氨酸/亮氨酸->甲硫氨酸/苯丙氨酸
门卫缬氨酸/亮氨酸到甲硫氨酸的突变通常发生在ALK L1196M、ROS1 L2026M、RET V804M和FGFR家族( FGFR1 V561M、FGFR2 V564M、FGFR3 V555M、FGFR4 V550M) (图5A )。对ALK和FGFR1中分别以亮氨酸和缬氨酸为门卫的激酶晶体结构分析表明，门卫氨基酸构象几乎是固定的。亮氨酸的χ1和χ2分别以182°和132°为中心，缬氨酸的χ1为54° (图5B )。将缬氨酸/亮氨酸突变为笨重的甲硫氨酸会导致抑制剂的空间位阻。例如，ALK L1196M /赛可瑞的晶体结构显示，极性和立体位阻的甲硫氨酸与赛可瑞中的甲基发生冲突，干扰其结合(图5D )，削弱了野生型中甲基与门卫亮氨酸之间的范德华相互作用。
FGFR1 V561M和FGFR2 V564F门卫突变是infigratinib耐药的主要靶位机制。infigratinib与FGFR1的晶体结构表明，二氯-二甲氧基苯基部分延伸到back pocket，与门卫Val561形成适当的范德华作用。缬氨酸突变为甲硫氨酸或苯丙氨酸，与二氯二甲氧基苯基发生空间位阻冲突，导致" on-target "获得性耐药(图5E )。
图5. 缬氨酸/亮氨酸门卫突变案例
靶向门卫突变的抑制剂研发
为了克服获得性耐药，一些针对性的新一代SMKI已被FDA批准上市。在此，我们将重点介绍具有代表性的针对门卫突变的新一代激酶药物，并强调该领域尚未满足的临床需求。
靶向异亮氨酸门卫突变的抑制剂
在ABL T315I、PDGFR T674I和KIT T670I中主要发现了从苏氨酸到异亮氨酸的突变。如结构分析中所述，突变往往导致氢键相互作用的丧失，并引入空间位阻冲突。新一代的SMKI通过避免空间冲突和/或与突变的异亮氨酸形成额外的相互作用成功地靶向这一突变。此外，别构激酶抑制剂也被开发用于克服Bcr-Abl T315I突变引起的临床耐药。
Bcr-Abl T315I
伊马替尼是第一个被批准用于治疗费城染色体阳性慢性粒细胞白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病( ALL )的Bcr-Abl抑制剂。然而，Abl激酶结构域的突变介导了伊马替尼的临床获得性耐药，其中门卫T315I突变最为常见，对第二代抑制剂达沙替尼和尼洛替尼仍不敏感。第三代抑制剂泊那替尼于2012年被FDA批准用于T315I阳性CML或T315I阳性ALL。泊那替尼在ABL中的共晶结构表明，连接哒嗪和N -苯基苯甲酰胺的炔烃连接子避免了与Ile315的空间位阻冲突，并与Ile315形成了良好的范德华相互作用(图6 )。
图6. 克服Abl T315I门卫突变抑制剂的研发
PDGFRα T674I和KIT T670I
胃肠道间质瘤是发生于胃和小肠的最常见的间叶源性肿瘤。KIT和PDGFR α基因突变是约80-85% GISTs的致癌因素。伊马替尼、舒尼替尼和瑞戈非尼已被批准作为GIST的一线、二线和三线治疗。然而，在长期使用舒尼替尼和瑞戈非尼治疗后，发生了与ATP结合口袋或KIT/PDGFR α活化loop区域的突变相关的耐药。
瑞普替尼( DCC-2618 ,图7)是FDA批准的用于治疗既往接受过3种及以上SMKIs治疗的GIST患者的四线药物。瑞普替尼类似物与KIT的共晶结构显示其以II型构象与KIT结合(图7 )。尿素部分与开关氨基酸Glu640形成氢键，使活化loop区域处于无活性状态。瑞普替尼的末端苯环占据了由Leu647和Leu783形成的开关口袋内部的R - spin。重要的是，氟溴取代的苯基与突变的门控蛋白Ile670形成了良好的相互作用，并且没有空间位阻。
图7. KIT and PDGFRα门卫突变抑制剂开发
甲硫氨酸门卫突变抑制剂的研发
在FGFR家族中，从缬氨酸到甲硫氨酸( V到M)的门卫突变已经被广泛研究：FGFR1 V561M，FGFR2 V564M，FGFR3 V555M，FGFR4 V550M和RET V804M。如结构分析所述，甲硫氨酸可以给抑制剂引入空间位阻和/或增加ATP的结合亲和力。SMKIs通过避免空间位阻冲突或与蛋白形成共价键增加结合亲和力，成功靶向VàM门卫突变。
FGFR门卫突变
成纤维细胞生长因子受体(FGFR)介导MAPK和PI3K/Akt通路，FGFR的异常已被证明是许多肿瘤的驱动力。3个FGFR抑制剂(图8)，erdafitinib ( JNJ-42756493 )，pemigatinib ( INCB054828 )，和infigratinib （BGJ398）已被FDA批准上市，并取得了显著的临床获益。然而，门卫突变与分子上位于back pocket的苯环基团存在空间碰撞，严重干扰了这些药物的结合，从而导致" on-target "依赖的获得性耐药。据我们所知，目前还没有针对FGFR的门卫SMKIs获批上市。
图8. FGFR门卫突变靶向抑制剂
RET V804M门卫突变
RET是一种跨膜受体酪氨酸激酶，主要表达于中枢和外周神经系统。突变、基因融合或过表达引起的RET信号异常导致一系列细胞内信号级联反应，是甲状腺癌、NSCLC等的驱动力。多个多靶点激酶抑制剂，如sorafenib，凡德他尼，卡博替尼，乐伐替尼和泊那替尼，被鉴定具有RET激酶抑制活性，但其中大多数由于门卫突变RET V804M/L突变而产生获得性耐药。
Selpercatinib (LOXO-292)是另一种高选择性的RET抑制剂，具有抗多种RET融合和突变的作用。它对RET和RET V804L/M具有较高的抑制活性， 结构表明二氮杂生物环庚烷适应弯曲的构象，以促进甲氧基吡啶向back pocket伸展，避免与突变的甲硫氨酸发生空间位阻冲突。Selpercatinib对含有RET蛋白改变的细胞，尤其是RET V804M突变的细胞显示出强大的体外和体内抗肿瘤活性。2020年，Selpercatinib被批准用于治疗伴有RET改变的肺癌/甲状腺癌。
图9. RET V804M门卫突变抑制剂研发
苯丙氨酸突变为亮氨酸的门卫突变靶向抑制剂研发
FLT3属于酪氨酸激酶超家族，主要表达于造血细胞。大约1/3的AML患者存在FLT3基因的异常，主要包括内部串联重复和酪氨酸激酶结构域突变。第一代多靶点激酶抑制剂米哚妥林和两个第二代FLT3抑制剂富马酸吉特替尼和奎扎替尼(图10)已被批准用于治疗FLT3突变的AML患者。尽管富马酸吉特替尼和奎扎替尼作为单药治疗的高应答率，但由于与TKD突变相关的获得性耐药，如激活环( D835Y/V/F )和或门卫突变 F691L，临床有效性有限。
吡西达替尼(PLX3397)是可以靶向CSF1R (IC50 = 13 nM)、KIT (IC50 = 27 nM)、FLT3 ( IC50 = 11 nM)的多靶点激酶抑制剂。F3-FLT3 F691L细胞和MOLM-14癌细胞具有获得性FLT3 F691L突变，IC50分别为97和670 n M。FLT3与吡西达替尼的共晶结构表明，中间的氨基吡啶部分避免了与突变的Leu691的空间位阻，并与Asp829形成氢键，以抵消与野生型FLT3的Phe691的π-π相互作用的损失。然而， FLT3激活环突变对Ⅱ型抑制剂吡西达替尼不敏感。吡西达替尼抑制表达FLT3 D835Y的Ba/F3细胞增殖的IC50值仅为4.7 μM。
图10 FLT3门卫突变抑制剂研发
结论与展望
门卫氨基酸是引起耐药最常见的突变位点，目前已开发出以靶向门卫突变为主的新一代激酶药物。尽管激酶家族中的门卫氨基酸类型多种多样，结构分析表明，门卫突变主要通过引入空间位阻冲突、减少与抑制剂的关键相互作用或增加ATP的结合亲和力来引起抗性。针对这些结构机制，人们已经设计和开发了几种新一代的激酶抑制剂，相信这些策略对于设计新的SMKI将变得越来越有价值。
参考文献：Zhou Y, Xiang S, Yang F, et al. Targeting Gatekeeper Mutations for Kinase Drug Discovery[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2022.