盐型筛选的方法有很多，但真正广泛应用的并不多，主要有溶液结晶，混悬打浆和高通量蒸发结晶等方式。溶液结晶一般是将游离态和酸/碱分别溶解于溶剂中，然后将酸/碱溶液滴加到游离态溶液中，也可以反向滴加，即将游离态溶液滴加到酸/碱溶液中，反应结晶得到晶体盐；而混悬打浆则是选用合适的溶剂将游离态和酸/碱配成混悬液，然后打浆反应成盐；高通量蒸发结晶一般分别将游离态和酸/碱溶解于溶剂中，将游离态溶液和酸/碱溶液依次加入至96孔板各个孔中，蒸发结晶。前面两种方法若得到澄清液，则可以通过添加反溶剂或者蒸发结晶尝试得到固体产物。通过96孔板可以同时筛选很多种对离子和溶剂，属于高通量筛选。但因为每个孔的容积有限，得到的样品量会比较少，不足以全部的表征（XRPD，DSC，TGA，NMR，甚至IC，HPLC等）。不同的公司或者研究人员都有各自的优选方法，当然也可以几种方法结合使用。至于哪种方法更合适筛选，本文会做简单的讨论，供大家参考。上周做了一个问卷调查，看大家盐型筛选更倾向于哪种结晶方法，截止今天的投票结果如下：
从投票结果看，选择溶液结晶和混悬打浆的人比较多，两者旗鼓相当，远高于高通量蒸发结晶。溶液结晶比较适合放大，而且起始是一个均相的体系，所以成盐反应完全。而正因为是均相体系，所以对于不容易成核的化合物就容易得不到晶体样品。而混悬打浆是非均相体系，可能发生反应不完全的情况，而且受溶解度的限制比较大。但其优势也在于其是非均相体系，属于异相成核，所以比较容易得到晶体盐。另外，混悬打浆适合大批量平行操作。高通量蒸发结晶虽然可以同时筛选很多对离子和溶剂，但蒸发结晶没有扰动容易产生高过饱和度，从而得到油或者亚稳晶型或者无定形样品。96孔板得到的样品量也不足以进行全套的表征，产生的样品很多，对仪器的要求比较高（需要使用高通量XRPD，或者手动测试，但手动需要耗费大量的人力和机时，而且转移过程会造成样品损失），这可能是选高通量蒸发结晶的人比较少的原因。综上，几种方法应该说都不是完美的，有各自的优缺点，那盐型筛选到底应该如何去做呢？
下面来看一篇文献，Fernández Casares A, Nap W M, Ten Figás G, et al. An evaluation of salt screening methodologies[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2015, 67(6): 812-822.。Ana Fernández Casares等人对比了三种盐型筛选的方法，三种方法分别为：原位成盐（混悬打浆），饱和溶液结晶和冷却蒸发结晶。其中原位成盐通常被用于临床前制剂开发，优点在于无需耗费太多的精力去提前制备盐，而是直接将游离态加入酸或碱的溶液中，得到的溶液或混悬液就可以直接用于给药。由于是直接用于给药，所以一般都是用水作为溶剂。
实验选择了两个溶解性差异很大的化合物进行比较，阿立哌唑和去甲文拉法辛，两个化合物均为游离碱。其中阿立哌唑（aripiprazole）溶解度很差，只有7.8 μg/ml，最强碱性位点的pKa为7.5。另一个化合物去甲文拉法辛（desvenlafaxine）溶解度较高，1.4 mg/ml，几乎是阿立哌唑的200倍。去甲文拉法辛最强碱性位点的pKa为8.9。两个化合物的化学结构式如下：
原位成盐（in-situ salt）的具体步骤如下：将60 mg的阿立哌唑加入到8-ml的样品瓶中，然后加入2 ml的100 mM酸溶液（部分酸在水中的溶解度比较差，所以将gentisic acid和benzoic acid溶解于methanol/water 90 : 10，succinic acid溶解于methanol，fumaric acid溶解于ethanol）。对于去甲文拉法辛，将90 mg样品加入至1.8-ml的HPLC样品瓶中，随后加入500 μl的1M酸溶液。上述混悬液在21°C下打浆5天。
饱和溶液结晶成盐（saturated solution crystallization）的具体步骤如下：制备阿立哌唑的饱和溶液（将300 mg样品加入10–40 ml溶剂中打浆3h，过滤得到饱和溶液）。对于去甲文拉法辛，使用两种溶剂进行筛选，分别为ethanol和tetrahydrofuran。将200 mg 的去甲文拉法辛样品加入20 ml 溶剂（10 mg/ml），打浆3h并过滤得到饱和溶液。分别取1ml上述饱和溶液至样品瓶中，然后加入化学计量比的1 M酸溶液（fumaric acid 用的是0.3 M）。在60°C搅拌1h，然后冷却至5°C，降温速率为10°C/h。
冷却蒸发结晶成盐（cooling-evaporative crystallization）的具体步骤如下：将约20 mg样品加入至1.8-ml的HPLC样品瓶中。随后称取化学计量比的酸到同样的样品瓶中，加入500 μl的结晶溶剂，API/酸/溶剂体系在Crystal16进行温度循环实验。加热至60°C打浆1h，然后冷却至5°C，降温速率为10°C/h，老化2天。如果没有固体析出，则挥发溶液直至溶剂挥发完。
实验共选取了17种常用的酸，酸的种类及对应的pKa如下表所示：
实验所选两个化合物最强碱性位点的pKa大于7.5，碱性相对较强，所以理论上适合采用原位成盐的方法进行增溶。如下表所示，对于阿立哌唑，采用原位成盐的方法，游离碱和sulfuric, p-toluenesulfonic, fumaric, citric, maleic, gentisic和tartaric acid共7种酸形成纯的晶体盐。通过进一步表征（NMR，TGA，和DSC）发现，前4种盐是水合物，后面3种为无水晶型，说明阿立哌唑的盐比较容易形成水合物。阿立哌唑和glucuronic, benzoic, succinic和glutaric acid四种酸没有得到盐，而是得到阿立哌唑游离碱的水合物。这几种酸的酸性相对较弱，可能是他们没有能和阿立哌唑成盐的原因。而其他几种酸，得到的是盐和游离态水合物的混合物：hydrochloride, benzenesulfonate, phosphate和malate。这意味着这几种酸是可以和阿立哌唑形成盐的，但需要调整成盐方法（结晶方式，溶剂种类，酸碱摩尔比等）以得到纯相的盐。此外，实验得到了阿立哌唑oxalate两种晶型的混合物。从实验结果看，是否能够形成盐和溶解度似乎也没有必然的联系，如p-toluenesulfonic和gentisic acid的溶解度都非常低，但依然得到了晶体盐。而最后几种酸，虽然酸性不强（和游离碱的pKa差值大于3），但溶解度也还可以（远高于p-toluenesulfonic和gentisic acid），但最终也没有成盐。后面的实验也证实，四种酸中的三种是可以和阿立哌唑成盐的。
由于去甲文拉法辛具有较高的溶解度，所以设置的反应浓度比较高（10 mg/ml）。然而，在加入酸溶液后得到的都是澄清液（除了phosphoric acid，5天后得到固体是游离态）。作者认为没有达到饱和，但笔者认为也有可能是过饱和的，但没有析出晶体。查阅文献发现去甲文拉法辛游离碱的溶解度随pH减小而增大，在0.1N盐酸溶液中的溶解度为31 mg/mL，所以实验中盐酸盐的溶解度应该低于175 mg/mL，过饱和但没有析出。这种情况也比较普遍，尤其对于溶解度相对比较高的化合物。在这个实验中，phosphoric acid的酸性是比较强的，但依然没有和去甲文拉法辛反应成盐，析出的是游离碱。很显然，这边未能成盐不是溶解度的问题，也不是磷酸的酸性弱，至于为什么没有得到盐还需要进一步的研究。
根据化合物在溶剂中的溶解度，采用tetrahydrofuran, acetone, ethyl acetate, 1,4-dioxane, toluene，acetonitrile作为溶剂，对阿立哌唑进行饱和溶液结晶筛选盐型，结果如下表所示。阿立哌唑和大多数酸都得到了晶体盐，除了在methanesulfonic acid, glucuronic acid, benzoic acid 和glutaric acid。在ethyl acetate和toluene中得到了最多的固体，而在acetone, acetonitrile, tetrahydrofuran和1,4-dioxane中得到的固体比较少。XRPD等结果显示17种酸中有13种和阿立哌唑成晶体盐。其中hydrochloride, sulfate, besylate, oxalate, maleate, gentisate, tartrate and malate是晶体盐，物理稳定，且只有单一熔点。Citrate和phosphate是溶剂化物。fumarate salt和p-toluenesulfonate多晶型情况比较复杂。与原位成盐的方式相比，饱和溶液结晶得到了更多的盐，尤其是无水晶型的盐。这主要是因为溶液结晶采用的是有机溶剂，而原位成盐用的溶剂主要为水。与原位成盐相比，饱和溶液反应得到的都是纯相的盐，没有出现混合物的情况。从这点而言，溶液结晶有优势。另外，还测试了不同的盐在水中的溶解度，所有的盐都比游离碱的溶解度高很多。几种溶剂化物在溶解度测试后晶型都发生了改变，这也是意料之中的。
通过冷却蒸发结晶对阿立哌唑进行盐型筛选的结果如下表。该实验中，17种酸得到15个盐。整体来说，通过冷却蒸发结晶得到的晶型比较多，比饱和溶液结晶的多。从实验过程看，20 mg样品加入500 μl的结晶溶剂，浓度高达40 mg/ml，所以很有可能得到的混悬液。加热至60°C打浆也不一定能溶清，所以该实验也属于混悬打浆并结合冷却、蒸发结晶。对于sulfuric和maleic acid，得到了新的无水晶型，而其他酸得到的新晶型均为水合物或者溶剂化物。通过cooling/evaporative方法，methanesulfonic acid和glutaric acid得到晶体盐。而这两个酸在其他两种方法中得到的是油或者无定形。此处充分说明方法选择对成盐筛选结果影响很大，如果有必要，可以采用多种方法进行盐型筛选。Glucuronic和benzoic acid通过任何方法都没有得到晶体盐。
对于盐型筛选，上述几种方法各有优缺点。而对于放大生产，使用的方法则相对单一，一般均为溶液结晶，主要分为冷却结晶和反溶剂沉淀，也可以是两者的结合。某些情况下还会加入晶种，以便对结晶更好的控制。混悬打浆一般不建议用于放大生产，因为有一定的放大效应，重复性也比较差。但也不是绝对不能用，下面介绍一个案例，Derdour, L., J. M. Reckamp, and C. Pink. "Development of a reactive slurry salt crystallization to improve solid properties and process performance and scalability." Chemical Engineering Research and Design 121 (2017): 207-218.。
化合物A是一个游离碱，高通量结晶筛选结果不是很理想。绝大多数实验得到的是无定形，得到的唯一晶体却是一个溶剂化物，命名为B。溶剂化物中溶剂含量太高而不适合开发。该游离碱计算的得到的pKa为1–3，所以推测可以和强酸成盐。盐型筛选后得到晶体盐，命名为C。进一步研究表明C具有较好的稳定性和较高的水溶性，所以被选择用于药物开发。
开发了C的结晶工艺用于制备毒理批次的样品，命名为工艺A。工艺A为一个反应结晶，将游离态的溶剂化物B溶解于二甲基四氢呋喃（MeTHF），然后加入对离子的乙腈（MeCN）溶液。该反应结晶过程需要加入微粉后的晶种。该工艺有下面几个问题：
对高活样品微粉化有一定风险
对产品颗粒的控制不好，产物有大量的团聚，造成不均匀
对溶剂的水含量比较敏感，需要使用无水溶剂，成本较高
为了解决样品颗粒和晶种需要微粉的问题开发了新的结晶工艺，命名为工艺B。将游离碱B在60 ◦C溶解于5V的MeTHF/MeCN 1/1 v:v，酸溶解于2.5V的MeCN，并将酸溶液加入至游离碱溶液中。热过滤后，加入晶种诱导结晶。60 ◦C下随后加入18V的MeTHF作为反溶剂。该过程无需加入微粉的晶种，比工艺A略有改进。而且通过添加反溶剂的速率可以控制产物粒径。当然，工艺B还是存在一些问题，比如：
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收率较低（ca 70%） -
在高温下对高饱和溶液进行澄清过滤操作，期间有自发成核的风险，而澄清过滤操作是GMP要求，无法避免 -
对溶剂中水含量要求较高，需要使用无水溶剂 -
产物有团聚
B在纯的MeTHF溶解度较高，~19 w/w% @25 ◦C。随着MeCN的比例增大，溶解度降低。而盐C在MeTHF中几乎不溶，但随着MeCN比例的增大，溶解度增大。此外，如果体系中含有0.8%的水，则溶解度会更大，这就是在工艺A和B中需要严格控制溶剂中水含量的原因。基于溶解度的结果，采用混悬打浆的方式进行C的结晶，这样就可以解决低收率，对水敏感，产品团聚的问题。原因如下：
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保证最终体系中MeTHF的含量达到一定值（高于88 wt%），这样C的溶解度远低于1 w/w%，收率会比较高。同时，水的影响也会比较小（相同水含量下，MeCN的含量越高，溶解度差值越大）。相比于其他两种方法，该方法需要的溶剂量也比较小，而且还可以回收母液用于下一批次的生产。 -
可以有效防止C的过饱和度达到峰值，那样会导致团聚和不均匀的粒度分布。混悬打浆反应结晶的过程：游离碱和酸不断反应成盐，析出，新暴露的游离碱继续与酸反应析出，直至最终全部转化为盐。所以不会出现C过饱和度太大的情况。
1：游离碱晶体的溶解；2：酸的解离（Kd: dissociation constant）；3：溶解的酸和碱的反应（k: reaction constant）；4：盐的结晶
上图是整个体系的平衡以及转化关系图。溶解的盐的浓度等于游离碱B溶解的浓度，不能超过B的溶解度。所以保持体系中有B的晶体就可以防止盐的浓度超过B的溶解度。最终的结果就是体系对盐的过饱和度不会很大。从而C不至于形成严重的团聚。所以该工艺会有下面的优势：
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澄清过滤在未过饱和的溶液进行，没有自发成核的风险。 -
反应在25 ◦C进行，而不是60 ◦C，可以防止solid encrustation。 -
对混合没有那么敏感，因为没有达到过饱和度峰值。
基于溶解度数据和上面的讨论，开发了新的结晶工艺，命名为工艺C。具体的细节如下：
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在25 ◦C将B溶解于一定体积的MeTHF -
溶液进行澄清过滤，并用MeTHF淋洗 -
加入MeCN使体系对于B是过饱和的 -
溶液冷却至5 ◦C使B发生自发成核，得到B的混悬液 -
将混悬液的温度升高至25 ◦C -
将酸的MeTHF加入至上述溶液，得到对于C的过饱和混悬液 -
在混悬液中加入C的晶种 -
加入剩余酸的MeTHF溶液，控制滴加速度以控制盐的形成速率 -
酸加完后，在25 ◦C打浆1小时，使C结晶完全
