PARP1是DNA修复的关键酶，是当前炙手可热的抗癌药物靶标。尽管PARP1抑制剂在临床上取得了巨大的成功，但其细胞毒性、耐药性的产生以及适应症的限制削弱了其临床治疗效果。为了解决这些问题，双PARP1抑制剂被认为是一种很有前途的策略。本文综述了近年来双靶点PARP1抑制剂的研究进展，总结了双靶点抑制剂的不同设计，并对其抗肿瘤药理学进行了介绍，为发现用于癌症治疗的双靶点PARP1抑制剂提供参考。
引言
1966年，PARP1 (英文全名：Poly [ADP-ribose] polymerase 1) 被鉴定为一种翻译后修饰，在细胞生理和代谢过程中发挥重要作用。PARP催化ADP核糖的多聚体与核蛋白共价结合来修复受损的DNA。因此，PARP通过维持基因组稳定性而密切参与细胞存活。1980年，以烟酰胺为药效团合成了第一代PARP抑制剂，但其抑制效果较弱。
随后在2005年发现了具有良好抑制能力的第二代PARP抑制剂。PARP1是ADP核糖基转移酶家族中最常见的成员，因其高度保守的蛋白序列而被广泛研究。大量研究表明，PARP1在多种肿瘤细胞系和患者的恶性组织中表达明显升高。因此，PARP1具有作为癌症治疗靶点的潜力(图1)。
图1. PARP1抑制剂研究进展
1990 - 2000年，一些PARP1抑制剂被初步开发用于增强化疗或放疗的抗癌活性。随着PARP1生物学领域的急剧扩展，目前已有6个PARP1抑制剂被批准用于临床，其中(奥拉帕尼、rucaparib、尼拉帕利、talazoparib、fluzoparib、pamiparib)已经为许多类型的癌症患者带来了显著的临床获益。2018年PARP1抑制剂耐药现象阻碍了其临床应用。因此，需要进一步的研究来促进PARP1抑制剂的临床应用并预防其不良反应。为此，人们采用了多种策略，包括筛选新型抑制剂、联合用药、设计或开发双靶点PARP1抑制剂等。与PARP1的单靶点抑制剂相比，双靶点PARP1抑制剂具有良好的协同作用，可以降低耐药性，避免不良反应，提高治疗效果，是一种更有前景的抗肿瘤药物开发。
PARP1的结构和生物学功能
PARP1包括6个亚结构域：N端、3个锌指结构域( ZFs )、核定位信号( NLS )、BRCA1 C端结构域( BRCT )、色氨酸-甘氨酸-精氨酸结构域( WGR )、螺旋结构域( HD )和ADP核糖基转移酶结构域( ART )。N端DNA结合域( DBD )包含三个锌指结构域，控制一些蛋白质-蛋白质相互作用和DNA结合。中心结构域是一个自修饰结构域( auto-modifying domain，AD )，包含BRCT和WGR作为自修饰的主要位点。由两个亚结构域( HD和ART)组成的C端催化结构域( CAT )是NAD +的活性结合位点。PARP1的催化中心是 ART结构域，为PARP家族所有成员共有。
鉴于PARP1结构的复杂性，其生物学功能也呈现出多样性。当DNA受损时，PARP1以其ZF结构域快速识别并结合断裂的DNA，促进DNA修复酶的结合，从而修复DNA (图2f )。PARP1抑制剂的主要作用机制是通过稳定DNA - PARP复合物，阻止DNA修复蛋白与损伤位点结合，从而捕获PARP1。然而，PARP捕获可以介导细胞毒性，特别是在同源修复缺陷的细胞中(图2g )。PARP1的功能突变影响BRCA1等DNA修复因子的募集，引起p53-p21功能失调，最终导致DNA损伤和细胞死亡。因此，靶向PARP突变为抗肿瘤PARP抑制剂的研发提供了新的研究方向(图2h)。
图2. PARP1结构以及生物学功能
PARP1双靶点抑制剂在肿瘤治疗中的应用
PARP1抑制剂的抗肿瘤作用依赖于PARP1的表达，因为癌细胞通常通过下调PARP1的表达来产生耐药性。一些PARP1抑制剂是药物流出物的底物，这些流出物被癌细胞加速排出体外，也会导致耐药。此外，一些BRCA缺陷的肿瘤可以重新激活同源重组修复(HRR)，从而损害PARP抑制剂的治疗效果。双靶点抑制剂通过协同靶向多个靶点，大大提高了PARP1抑制剂的抗肿瘤效果，降低毒性，逃避耐药。本文对各类双靶点PARP1抑制剂的研究进展进行总结，并对其作用机制进行阐述(表1)。
PARP1和BRD4双重抑制剂
溴结构域蛋白4 ( BRD4 )是一种正性转录延伸因子b (p-TEFb)激活蛋白，调节多种肿瘤发生相关基因的表达，在乳腺癌中与PARP1有重要的交叉关系。抑制BRD4可以显著增加HR缺陷，抑制参与DNA复制和DNA损伤信号的基因，如BRCA1和Rad51的表达(图3A )。化合物1与典型的BRD4抑制剂RVX-208具有相似的结合模式，是优化BRD4/PARP1双靶向的合适先导物。引入甲氧基取代和用吗啉取代芳杂环哌啶得到化合物2，其抑制活性略有增强。然后通过引入环丙基(哌嗪-1-基)甲酮基团合成了化合物3。最后，引入苄胺基团作为锚，通过乙二醇链与PARP1相互作用，得到化合物4 ( ADTL-BPI1901 )，该化合物对BRD4和PARP1具有良好的抑制活性，IC50分别为0.4 μM和4.6 μM。化合物4是第一个BRD4-PARP1双重抑制剂，在BRCA1/2野生型乳腺癌中诱导显著的细胞凋亡和G1期细胞周期阻滞。
图3.PARP1与其他靶标的协同机制
化合物5基于veliparib和BI-2536的结构设计并合成了具有强PARP1和BRD4抑制( PARP1 IC50= 150 nM , BRD4 的IC50= 237 nM)。为了增强这些抑制作用，四氢生物蝶呤从BI-2536与来自veliparib的1H-苯并咪唑-4-甲酰胺通过一系列不同取代的苯环连接。
通过将苯和四氢生物雷克萨斯酸之间的NH的氢替换为甲基，化合物6对PARP1 (IC50 = 13 nM)和表现出最强的抑制活性 对BRD4的IC50为101 nM。此外，化合物6在SW1990细胞和SW1990移植瘤中表现出协同抗肿瘤作用，通过阻滞G1/S细胞周期，抑制DNA修复，增加与自噬相关的细胞死亡。
PARP1和PI3K双重抑制剂
肌醇磷脂3-激酶(PI3K)在多种肿瘤中异常激活，抑制PI3K激活下游信号ERK，从而使BRCA1/2失活，破坏HR修复，导致BRCA1/2缺陷的肿瘤对PARP1抑制剂敏感。协同抑制PI3K和PARP1可通过上调cH2AX和多聚二磷酸腺苷核糖基化增加DNA损伤(图3b)。化合物8为新的PARP1/PI3K抑制剂，通过合并PARP抑制剂奥拉帕尼和PI3K抑制剂BKM120的药效团而开发的，对两者均表现出强的抑制活性。虽然其对PARP1的抑制活性与奥拉帕尼相当，但其对PI3Ka的抑制活性有待进一步提高。将嘧啶骨架替换为1,3,5-三嗪，并将4-(CF3)-吡啶-2-胺部分替换为嘧啶-2-胺基，合成了化合物9，其对PARP1/PI3K的抑制活性略有提高。
PARP1和HDAC双重抑制剂
人类组蛋白去乙酰化酶( histone deacetylase，HDAC )可以去除组蛋白N端赖氨酸残基上的乙酰基，在染色体结构修饰和基因表达中具有重要作用。抑制HDAC可以下调 HRR基因，导致" BRCAness "和PARP1的敏感性 PARP抑制剂(图3c)。伏立诺他(SAHA)是一种泛组蛋白去乙酰化酶抑制剂，化合物15是将SAHA的异羟肟酸基团连接到奥拉帕尼具有良好抑制活性的酞嗪部分合成的IC50为68.15/5.02 nM，Hdac1/6的IC50为27.26/8.21 nM)。化合物15可以诱导PARP裂解和组蛋白的高乙酰化，增强DNA损伤生物标志物cH2AX的表达，降低BRCA1和RAD51的水平，通过调节线粒体和死亡受体介导的途径导致DNA损伤和肿瘤细胞死亡。
PARP1和微管双重抑制剂
微管对于细胞结构和功能的维持以及多样的生命过程至关重要。微管靶向剂(microtubule targeting agent，MTAs)可通过促进微管聚合或解聚来破坏细胞微管功能。最近的研究表明，MTAs可以干扰DNA损伤修复中的关键转运蛋白，包括ATM、ATR、BRCA和Rad51，导致HR缺陷和DNA损伤。MTAs还刺激PARP1自核糖基化，与重要的有丝分裂检查点蛋白(CHEK)结合并稳定，从而抑制癌细胞的细胞周期。同时靶向PARP1和微管聚合可以导致DNA损伤的扩增和延长，增强癌症敏感性，并拓宽抗肿瘤疗效，同时降低与MTAs相关的肿瘤耐药和剂量限制性周围神经病变的风险(图3d)。第一个双靶点PARP1和微管聚合抑制剂化合物20 (AMXI-5001)与单靶点PARP1抑制剂或微管抑制剂相比，表现出更多的生化和细胞毒性。
PARP1和拓扑异构酶的双重抑制剂
拓扑异构酶(Topo)可引起DNA单链断裂(SSBs)或DSBs，但PARP1可修复Topo抑制剂引起的DNA损伤，使肿瘤细胞对Topo抑制剂产生耐药。因此，抑制Topo和PARP1可以克服耐药，改善预后。NU-1085的苯并咪唑甲酰胺被认为是开发PARP抑制剂的有吸引力的支架，苯并咪唑衍生物是一种良好的Topo抑制剂。
PARP1和TNKS1 / 2双重抑制剂
端锚聚合酶(TNKS1/2)在端粒维持和DNA修复中起关键作用。它介导多聚ADP核糖基化诱导的轴降解，导致破坏复合物活性降低，β-连环素水平上调，激活Wnt/b连环蛋白信号通路。抑制TNKS1/2可诱导" BRCAness "表型，并通过抑制Wnt/β-连环素信号通路使BRCA缺陷的肿瘤细胞对PARP1抑制剂敏感(图3e)。因此，同时抑制PARP1和TNKS1/2在肿瘤治疗中具有协同作用，克服了对PARP1抑制剂的耐药性。化合物24 ( E7449)被鉴定为第一个新型PARP1/2和TNKS1/2双靶点抑制剂，在结肠癌细胞系中靶向Wnt/β-catenin信号，并在BRCA缺陷的异种移植动物模型中显示出显著的抗肿瘤疗效。
PARP1和PD-1/PD-L1双抑制剂
近年来，免疫检查点阻断已成为多种肿瘤的有希望的治疗方法，但在其他肿瘤中尚未取得进展，如三阴性乳腺癌( TNBC )。60抑制PARP1通过GSK3b失活导致PD-L1过表达，使肿瘤细胞逃避T细胞的免疫攻击。因此，协同抑制PARP1和PD-1/PD-L1可有效杀伤肿瘤细胞(图3E )。PARP1抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂的联合应用可有效克服耐药，提高靶向PD-1/PD-L1的治疗效果。与联合治疗相比，药物结合物由于具有更好的溶解性和药代动力学，通常表现出相对优越的药物疗效。通过在N端修饰奥拉帕尼的哌嗪环，将PD-L1抑制剂BMS001与奥拉帕尼通过不同的连接子连接，设计了化合物27 - 29，在不改变其PARP1抑制特性的情况下，表现出比单独药物~2-20倍的细胞毒性，尤其是对内源性表达PD-L1的TNBC细胞。
结束语和未来方向
尽管双靶点抑制剂具有诸多优势，但其发展也面临挑战。首先，通过连接或融合两个单靶点分子的药效团来设计新颖的双靶点结构是可行的，但并不能保证它们的协同作用能够达到预期的抗癌效果。高通量筛选得到的化合物准确性也相对较低。因此，设计有效的双靶点抑制剂仍在开发中。其次，双靶点抑制剂两个靶点的抑制活性不一致也会影响其体内药效。尽管已经发现了许多有效的PARP1双靶点抑制剂，但很少进入临床应用，主要是因为它们的毒性和耐药性。近年来，基于新的化合物设计和结构改造，获得了更多具有更好生物活性的化合物，展现出克服耐药性、提高癌症治疗有效性的潜力，使双靶点PARP1抑制剂能早日进入临床应用。
参考文献：Zhang J, Zhang J, Li H, et al. Dual-target inhibitors of PARP1 in cancer therapy: a drug discovery perspective[J]. Drug Discovery Today, 2023: 103607.