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随着二代测序技术的发展和普及，转录组测序技术（RNA-seq）已经成为科学研究中不可或缺的工具。但在转录组测序中仍面临很多挑战，比如对于流式分选细胞、早期胚胎、穿刺等珍贵样本、难获取样本，若total RNA质量差或起始量低，构建高质量的转录组文库、拿到高质量测序结果会存在一定的困难。为此吉因加测试了mRNA低起始量建库流程，选用人细胞样本和小鼠肝脏组织样本进行以下实验。
实验设计
将同一来源的人细胞和小鼠肝脏组织样本，分别设置四组，分别以10ng、50ng、100ng、200ng起始量投入建库，人的样本每组设置3个技术重复，小鼠样本每组设置2个技术重复。
实验结果
1. 数据质控
通过去接头序列、过滤低质量、N碱基(表示无法确定碱基信息)后，得到高质量clean data，基本数据质控结果如下表所示：20个样本均建库成功；数据有效率（effective rate）>98.7%；GC含量均在49%~51%之间；Q20 >97%、Q30 >92%、rRNA比例 <3%。不同建库起始量样本的各项数据质控指标均一且合格。
表 数据质控结果
2. 比对分析
通过STAR 2.7.6a比对软件，将质控后得到的clean data比对到参考基因组，并对比对结果进行评估和质控。人细胞和小鼠组织不同起始量建库样本平均 mapped_rate为96%~98%；人样本中，不同建库起始量梯度平均unique_mapped_rate为95%左右，组内标准差小于1%；小鼠样本不同建库起始量梯度平均unique_mapped_rate为89%左右。不同起始量建库样本比对率一致且合格，表明低起始量建库实验流程稳定、下机产出及数据质量较好，建库质量和一致性较高。
图1 比对率分析（人）
图2 比对率分析（小鼠）
3. 样本相关性分析
样本间的相关性反映了样本间的相似程度。相关系数越接近1，样本间的相似度越高，样本品间的差异基因也越少。根据各建库起始量样本的表达矩阵文件，采用pearson相关性系数评估样本间基因表达量的相似性，分别绘制人和小鼠样本相关性热图。结果如下，12例人细胞建库样本中，同一起始量组内重复相关性和不同起始量样本间一致性大于0.97；小鼠组织样本间一致性均大于0.98。表明分组内样本重复性良好，且低起始量建库与常规建库的基因表达量的一致性较高，即mRNA低起始量建库数据可准确进行基因表达定量及差异分析。
图3 样本间基因表达量的
相关性分析（人）
图4 样本间基因表达量的
相关性分析（小鼠）
小 结
综上所述，针对质量较好的核酸，mRNA低起始量建库实测数据（10ng、50ng、100ng）产出及测序质量表现优异：数据有效率高达98.7%，Q30均高于92%，rRNA比例低于3%，比对率高于96%，组内样本一致性大于97%；且低起始量建库样本的各项指标与常规建库（200ng）表现一致，基因表达量相关性大于0.97。
吉因加低起始量mRNA测序产品以专业的技术研发团队，经验丰富的实验团队和稳定高效的测序平台为坚实后盾；可确保在核酸总量有限的情况下，也能高效准确的完成mRNA文库的构建，并拿到高质量的分析结果，最大程度保留原始核酸中的有效信息，为结果的准确性提供保障。
*数据来源：吉因加深圳实验室
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