在这个千姿百态的世界里，每天都面临着成千上万的选择。拥有选择恐惧症的你，circRNA建库方法是不是又让你头疼不已？
目前主流的circRNA建库方法有两种：去核糖体建库和RNaseR去线性建库。
术语表
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去核糖体建库可获得全部circRNA，lncRNA和mRNA信息。RNase R仅能获得部分circRNA。
机制解释
上文已经介绍过，去核糖体建库可以获得全部circRNA、lncRNA和mRNA信息。从分析的角度来看，circRNA作为一个非编码产物，将其作为Biomarker，需要对于其作用机制进行一定程度的探讨，而没有mRNA的测序结果单纯进行miRNA海绵的分析是不可靠的手段。其分析的miRNA海绵的机制并没有mRNA的支撑，对于表型的影响难以界定，即使界定也缺乏真实转录组依据，会存在一定程度的影响。
利用去核糖体建库最大的优势，就是可以进行联合分析，进一步准确地解释circRNA可能的机制。
如WGCNA功能预测，根据基因表达模式进行分类，每一个类群代表具有类似的表达模式，可以把作用相似的circRNA、lncRNA、mRNA都归为一类，同时说明这些circRNA和lncRNA具有mRNA相同的GO&Pathway。WGCNA如下图所示。
2. 背景清楚
circRNA对于host基因分析很看重，本文所引用的大部分高分文章都探讨了这个问题，这是需要mRNA测序结果支撑的。同时检测circRNA和mRNA的目的就在于此，目的是要对于原位基因进行探讨。
RNase R去线性建库去掉了mRNA，造成的直接影响就是：无法判别circRNA的富集情况。没有了mRNA这个参照，无法判别circRNA到底是多是少，自然也无法对原位基因进行探讨。
如果使用不经任何处理的样品作为参照，已有文献证明，会增加一定程度的背景误差[1]。
这一比较非常有意义，事实上，如下图[4]所示，有相当多的circRNA含量比原位的mRNA还要高哦~
3．CircRNA全面
已有研究表明，在使用RNase R去线性建库时，一些circRNA也会被RNase R降解，导致circRNA信息不全面。例如，JeckWR等人已经证实，CDR1as/ciRS-7就会被RNase R降解，并不会出现在建库信息中[1]。
不仅如此，一篇发表在NatBiotechnol上的文献指出，RNase R去线性建库主要依据的是lariats end，但有一些线性RNA的3'端修饰后导致RNase R不能识别，直接造成去线性过程不彻底。
同时，该文献还指出，RNase R去线性建库也会有3‘保护的lncRNA存在，也并不是纯粹的circRNA，因此也会存在影响。而采用去核糖体建库对circRNA有较好的检测精度，完美避免这一系列问题，并且能检测mRNA & lncRNA，如下图所示[5]。
为了让烈小冰的推荐更有说服力，让我们看看国际大牛们是怎么选择的吧！下图即为统计的2012—2015 circRNA发表文章所采用的建库和鉴定方法等。
可以发现，随着时间的推移，越来越多的文章放弃了RNase R去线性建库，转而使用去核糖体建库，这已经是circRNA前沿研究的大势所趋啦[6]~
让我们再来举个例子吧！
《Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conservedand Dynamically Expressed》
Mol Cell. 2015 Jun 4; 58 (5): 870-85.
本研究采用实验测序数据和数据库数据相结合的方法，研究不同物种大脑中circRNA的表达，期望揭示circRNA在神经系统的表达特点。
下图是烈小冰总结的实验流程图
结果显示，在不同的脑部位以及神经细胞的不同结构，circRNA的表达量不同，表达水平存在明显差异。
mRNA和circRNA在大脑不同区域的分布
继而对不同发育时期的胚胎脑皮质神经元进行研究，发现：随着分化程度的升高，绝大多数circRNA的数目增多。后续挑选差异表达最明显的circRNAs进行qRT-PCR验证，结果一致。
神经元分化过程中circRNA差异表达分析
同时发现，在小鼠大脑中鉴定出的circRNAs，有4522个在人脑中也同时表达。挑选其中保守性最强的19个circRNA，利用RNase R去线性建库进行验证，保守性得到证实，甚至某些circ RNA在果蝇脑中也能鉴定出来哦~
总结：本文发现，在大脑中，circRNAs具有明显的表达和序列保守性。同时还提供了circRNA脑内表达图谱和重要circRNA功能及其作为生物标记的证据。
尤其值得我们借鉴的是，本文利用去核糖体建库法进行前期筛选，再利用RNase R去线性建库进行后期验证，绝不仅仅是一家之言，有兴趣的主公还可以查看这篇文章：Neural circular RNAs are derived from synaptic genes and regulatedby development and plasticity。
如果circRNA是您的重点研究对象，烈小冰推荐使用去核糖体建库，不但能预测新的circRNA，还能进行circRNA-mRNA联合分析哦~ 当然具体问题还要具体分析，如果主公您还纠结的话，欢迎拨打400-065-1811免费查询，烈小冰随时恭候您~
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Jeck WR, et al. Circular RNAsare abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA 2013, 19:141–157.
Memczak S, et al. Circular RNAsare a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature 2013, 495:333–338.
Suzuki H, et al. A view ofpre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. Int J Mol Sci 2014, 15:9331–9342.
Rybak-Wolf A,et al. Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conserved andDynamically Expressed. Mol Cell. 2015 Jun 4;58(5):870-85.
Jeck WR,et al. Detecting and characterizing circular RNAs. Nat Biotechnol. 2014May;32(5):453-61.
Chen I,et al. Biogenesis, identification,and function of exonic circular RNAs. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2015Sep-Oct;6(5):563-79.
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