研究背景
骨关节炎（OA）作为全球主要致残原因之一，影响超5.95亿成年人，其核心病理特征是关节软骨渐进性降解，给患者与社会带来沉重负担。当前临床软骨修复策略（如微骨折、自体软骨细胞移植等）存在修复周期长、效果欠佳等局限——传统生物材料修复依赖内源性细胞募集与增殖，往往导致修复过程迁延；而软骨类器官（COs）作为干细胞定向分化形成的微型三维组织，兼具天然软骨的结构与功能特性，无需依赖内源性细胞，有望大幅缩短修复周期，成为软骨再生的新型策略。
基本信息
DOI：10.1186/s40779-025-00625-z
论文题目：Accelerating cartilage regeneration with DNA-SF hydrogel sustained release system-based cartilage organoids
发表期刊：Military Medical Research
研究总结
本研究基于甲基丙烯酰化丝素蛋白（SilMA）水凝胶，通过丙烯酰化聚乙二醇NHS酯（AC-PEG-NHS）共价接枝葡萄糖胺（Glu）与TD-198946，构建DNA-丝素蛋白（DNA-SF）水凝胶缓释系统（DSRGT），结合投影式光固化生物3D打印技术，实现骨髓间充质干细胞（BMSCs）定向分化为毫米级软骨类器官（COs）。
DSRGT水凝胶与软骨类器官具有以下特点和优势：
（1）精准药物递送：AC-PEG-NHS共价接枝实现Glu与TD-198946长效缓释，避免传统物理包裹的药物暴释问题，28天内持续支持软骨分化。
（2）优异仿生性能：DNA-SF双网络结构模拟软骨ECM，孔隙率达56.44±3.88%，孔径约277.6±18.75μm，保障细胞迁移与营养交换；力学性能匹配关节环境（储能模量G′>损耗模量G″，压缩模量适配软骨生理需求）。
（3）高效软骨再生：4周龄COs移植后8周，软骨缺损修复评分（ICRS）达10.08±0.79，表面粗糙度（Ra）与健康软骨无显著差异，再生组织中ColⅡ与ACAN表达显著高于对照组。
（4）高生物安全性：体内毒性评估显示，DSRGT与COs对大鼠心、肝、脾、肺、肾无损伤，血常规及肝肾功能指标正常，无系统性毒性。
EFL合作产品
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产品名称 |
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EFL-SilMA-001 |
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EFL-AC-PEG-NHS-2K |
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EFL-BP8601 Pro |
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研究参考
1. DSRGT水凝胶与软骨类器官（COs）的制备
（1）DSRGT水凝胶制备
原料配比：在pH 7.4的PBS中，37℃下溶解并混合以下成分：10 wt% SilMA、0.25 wt% LAP、5 wt% Pep-RGDfKAC、100 nmol/L TD-198946（预溶于DMSO）、10 mmol/L Glu、4.5 wt% AC-PEG-NHS、500,000 nmol/L单链DNA（ssDNA）。
共价接枝机制：AC-PEG-NHS的NHS酯基团与Glu、TD-198946的氨基反应，丙烯酸酯基团与SilMA反应，实现两种活性分子在DNA-SF水凝胶网络的稳定接枝。
光交联与3D 打印：DSRGT前驱液经365 nm紫外光（20 mW/cm²，17 s）交联成胶；采用DLP 3D打印机打印直径2.5 mm的球形支架，层厚100 μm，保障结构均一性。
（2）软骨类器官（COs）构建
细胞接种：将第3代大鼠BMSCs（1×10⁶ cells/mL）与DSRGT前驱液混合，通过DLP系统打印成细胞负载微球。
成软骨诱导培养：在含1 mmol/L丙酮酸钠、10 ng/mL TGF-β3、0.1 μmol/L地塞米松、1% ITS、1 μmol/L抗坏血酸-2-磷酸的诱导培养基中培养，每2天换液，分别收集1、2、4、6周龄COs进行表征。
2. DSRGT水凝胶与COs的表征验证
（1）水凝胶结构与性能
形态与孔隙：FE-SEM显示DSRGT呈均匀多孔结构，表面与内部孔隙连通，孔隙率56.44±3.88%，孔径277.6±18.75 μm，利于细胞黏附与营养交换；与DSR（无Glu/TD-198946）、DSRG（仅含Glu）、DSRT（仅含TD-198946）相比，孔隙参数无显著差异，证明接枝分子不破坏网络结构。
图1 在DLP系统中打印出的带有DSR、DSRG、DSRT和DSRGT的球体的场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）图像
力学与流变性能：频率扫描显示DSRGT的储能模量（G′）始终高于损耗模量（G″），呈现典型水凝胶弹性特征；剪切变稀行为（黏度随剪切应力降低）利于3D打印，且PEG分子引入使黏度适度降低，提升打印流畅性。
图2 DSR、DSRG、DSRT和DSRGT的流变曲线以及粘度曲线
缓释与降解：DSRGT在PBS中28天内实现Glu与TD-198946平稳释放，前3天快速释放42.26±3.67%，21天累积释放89.85±2.98%，28天达95.94±2.59%；降解实验显示6周内残留质量45.28±8.85%，降解速率匹配COs发育周期，避免过早失去支撑或长期残留。
图3 DSR、DSRG、DSRT和DSRGT的降解速率、膨胀率以及Glu和TD-198946在DSRGT中的释放曲线
（2）生物相容性验证
活死染色：BMSCs与DSR、DSRG、DSRT、DSRGT共培养1、3、5天，活细胞比例均> 90%，死细胞极少，各组无显著差异，证实水凝胶无细胞毒性。
细胞增殖与迁移：CCK-8实验显示各组BMSCs增殖活性随培养时间上升；划痕实验与Transwell实验证实，DSRGT组12小时细胞迁移率达55.09±1.08%，显著高于其他组，归因于TD-198946激活Notch3信号通路促进迁移。
图4 DSR、DSRG、DSRT和DSRGT对骨髓间充质干细胞的生物相容性和迁移性的影响
3. COs的体外生物活性评估
（1）成软骨分化能力
基质合成检测：阿尔新蓝染色显示，DSRGT组7、14天成软骨诱导后糖胺聚糖（GAG）染色最强；DMMB法与ELISA定量证实，14天时DSRGT组GAG含量（归因于Glu）与ColⅡ含量（归因于TD-198946）显著高于其他组。
基因与蛋白表达：qRT-PCR显示，DSRGT组14天SOX9、ColⅡ、ACAN mRNA表达最高，ColⅠ、ColⅩ表达最低；Western blot验证ACAN（250 kDa）、ColⅡ（180 kDa）、SOX9（56 kDa）蛋白表达水平在DSRGT组最优，证实其抑制纤维化与肥大的能力。
图5 骨髓间充质干细胞通过DSR、DSRG、DSRT和DSRGT实现的成软骨分化能力
（2）COs发育周期优化
形态与染色分析：1周龄COs无明显形态变化，SOX9表达强（早期成软骨标志）；2周龄表面细胞致密，4周龄形成多层结构，GAG含量最高（阿尔新蓝与番红O/固绿染色最强）；6周龄因药物释放完毕、营养交换受阻，内部出现凋亡空泡。
免疫荧光验证：4周龄COs ColⅡ、ACAN表达最高，ColⅠ、ColⅩ表达最低，证实为最优透明软骨表型，故选择4周龄COs进行体内实验。
图6 对培养2周、4周和6周的细胞系进行评估
4. COs的体内治疗效果评估
宏观与表面性能：8周时CO组缺损填充完整，表面光滑（ICRS评分10.08±0.79），原子力显微镜（AFM）显示表面粗糙度（Ra）与Sham组无显著差异，显著低于对照组与DSRGT组。
图7 治疗后4周和8周时再生软骨的宏观评估
机制验证：Western blot显示CO组p-p38（38 kDa）、p-ERK（42 kDa）、p-JNK（46 kDa）蛋白表达显著升高，证实MAPK信号通路激活是软骨再生的关键机制；加入ERK抑制剂PD98059后，COs的ACAN、ColⅡ表达显著降低，进一步验证通路作用。
图8 对缺损组、对照组和健康组再生的软骨进行mRNA分析
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